【背景和目的】原发性肺动脉高压(Primary Pulmonary Hypertension，PPH)是一种以肺血管阻力进行性增加和右心功能衰竭为特征的的恶性肺血管疾病，特征性的病理改变为小肺动脉内膜纤维化，中膜肥厚，外膜增生，丛样病变及动脉管腔闭塞。PPH对传统的治疗药物反应差，大多数病人在确诊后2-3年死亡，尽管一些新的药物如前列腺类似物，内皮素受体拮抗剂和磷酸二脂酶5抑制剂已经显示了对重度PPH病人的血流动力学，运动耐量和生存率具有肯定的作用，但PPH病人长期的预后仍然不容乐观。因此，寻找对这种疾病新的治疗方法就具有了非常重要的意义。在过去的几年中，对PPH病理生理机制的研究已经取得了很大的进展。已有证据强烈地提示内皮细胞丢失和内皮功能不全在PPH的发生和发展中起着十分重要的作用。一些环境刺激包括肺血流增加产生的切应力，病毒感染和肺泡低氧可以导致具有遗传易感性个体的内皮损伤。内皮损伤导致休眠期内皮细胞凋亡，肺血管内膜失去稳定性和内皮细胞异常增生。肺内皮细胞功能障碍使扩血管物质如一氧化氮和前列环素分泌下降，而缩血管物质如血栓素A2和内皮素-1分泌增加，结果导致肺血管收缩。内皮损伤后屏障作用下降，一些细胞因子渗出起动中层平滑肌细胞增生，同时血管平滑肌细胞和外膜对管壁压力增加出现适应性肥厚。内皮功能障碍增加了各种促血栓形成物质的生成和减少了抗血栓形成物质的分泌，结果产生了高凝状态，血栓使肺血管腔进一步狭窄，促进了PPH的形成。这些证据支持内皮功能障碍在肺血管结构变化过程中起着中心环节的作用。内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells，EPCs)是来源于骨髓的多能干细胞亚群，越来越多的证据支持EPCs在出生后缺血组织的新血管形成中起着重要作用。进一步研究发现，在组织遭受缺血、损伤或在外源性细胞因子以及药物的刺激下，动员骨髓中的EPCs进入外周循环，定向迁移到血管再生区，增强机体血管再生，改善内皮功能。在成熟个体内，EPCs可以在内皮损伤裸露的部位形成一个细胞补片或作为细胞贮存池更替功能障碍的内皮细胞。自体EPCs移植有可能成为PPH新的治疗选择。本研究的目的是建立肺动脉高压(pulmonary hypertension，PH)犬模型，观测PH形成前后犬外周血内皮祖细胞的数量和功能变化，并在PH形成后进行自体内皮祖细胞移植，观察移植前后肺循环血流动力学和组织学改变，初步探讨内皮祖细胞移植治疗PH的机制，为PPH的细胞治疗提供实验和理论依据。【实验方法】1、分组：14只雄性beagle犬，分别进行标记分成3组：EPC移植组(transplantation，T)6只，PH对照组(control，C)6只和空白对照组(sham，S)2只。2、PH模型的建立：经戊巴比妥30mg／kg腹腔注射麻醉，动物自主呼吸。行血流动力学测定，然后将脱氢野百合碱(dehydromonocrotaline，DHMC)(3mg／kg)经漂浮导管注入右心室诱导慢性PH模型(T组和C组)，S组同法注射等体积二甲基甲酰胺。于注射后第42天(六周末)重复血流动力学测定。3、血流动力学检查：穿刺右颈内静脉，置入5F动脉鞘，再经动脉鞘送入5F swan-Ganz漂浮导管至右心房，右心室，肺动脉，测定血流动力学参数包括中心静脉压(CVP)，右室压(RVP)，肺动脉收缩压(sPAP)，肺动脉平均压(mPAP)和肺毛细血管楔嵌压(PCWP)。穿刺左股动脉连续监测系统血压(SAP)。以热稀释法测定心输出量(CO)。总肺血管阻力(TPVR)由平均肺动脉压除以心输出量计算所得。4、血气分析和内皮素测定：分别在基础状态、注射DHMC后6周和10周进行血气分析和内皮素测定。5、EPCs数量和功能测定：T组和C组共12只beagle犬，先后在注射DHMC前和注射后6周进行血流动力学检查后经置入颈内静脉的5F动脉鞘采血20ml。以Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(peripheral bloodmononuclear cells，PBMCs)并进行体外培养。用倒置荧光显微镜计数UEA-I和DiLDL双染色阳性细胞数量，流式细胞仪测定AC133+KDR+细胞数量。并检测粘附和迁移能力及血管生成能力。6、EPC移植：在DHMC注射后第35天时，经右股静脉采血60ml行EPC分离培养。应用流式细胞仪对培养获得的EPCs进行表型检测。为示踪移植细胞的去向，使用Dil染色和Feridex体外标记两种方法对EPCs进行标记(各2只犬)。在DHMC注射后第42天完成血液动力学测定后，T组将2ml含约1．5×10~6个EPCs的培养液经漂浮导管注入右心室，C组和S组注入2ml不含EPCs的培养液。7、磁共振成像(MRI)：采用MRI技术(SE-T2W I，FSE-T2W I，GRE-T2W I序列)分别对移植前后犬肺脏进行扫描。8、组织形态学检测：在10周末处死动物取出心肺，取右肺立即液氮固定后作5μm冰冻切片，荧光显微镜下观察经Dil染色的EPCs在组织切片中存在情况。取部分肺组织染色后做病理组织形态学检查，计数毛细血管数量，计算肺小动脉中膜厚度的百分比和右心指数。【结果】1、DHMC注射后PH形成12只Beagle犬(T组6只和C组6只)注射DHMC后11只存活，1只(C组)于第二天死亡．注射DHMC后六周复查血流动力学测定示肺动脉平均压(mPAP)从11．4±1．7增高到19．4±1．5 mmHg(t=16．455，P<0.001)，肺血管阻力从3．2±0．7 mmHg·min·m~2／L增高到5．1±0．8 mmHg·min·m~2／L(t=4．969，P=0．001)；而心率、中心静脉压、体动脉收缩压、右心室收缩压、心指数前后对比无统计学差异。血气分析指标无统计学差异，而内皮素从1．37±0．03pg／ml增高到1．63±0．04 pg／ml(t=3．010，P=0．013)。2、EPCs特征在第1周接种到培养板上的大约25％的犬PBMCs生长为贴壁细胞，在头3天，贴壁与非贴壁细胞在光镜下都呈圆形，在培养的第2周，越来越多的细胞生长为梭形的内皮样细胞。在培养的3周末，出现典型的铺路石样。培养7天后，流式细胞仪检测贴壁细胞表面标志，表达KDR：78．0±7．8％，CD34：28．7±6．9％，AC133：17．1±8．1％。荧光显微镜双染色鉴定显示大部分贴壁细胞能同时摄取UEA-I和DiLDL。4、PH形成后EPCs数量和功能PH形成后，经流式细胞仪分析的AC133+KDR+细胞数量从633．8±39．3cells／ml下降到210．4±26.7 cells／ml(t=32．758，P<0．001)。体外培养7天后的UEA-I和DiLDL双染色阳性细胞数量从42．2±5．6 cells／×200视野减少到23．3±6．1 cells／×200视野(t=10．679，P<0．001)。贴壁细胞数由32．7±8．2 cells／×200视野下降到28．0±5．7 cells／×200视野(t=2．891，P=0．016)。迁移到低层的细胞数从12．6±4．7 cells/×200视野下降到9．4±3．4 cells／×200视野(t=2．292，P=0．045)。PH形成后的外周血EPCs在体外成血管试验中形成的血管数为11．7±3．0／×200视野，而基础时外周血EPCs的成血管数量为20．8±2．8／×200视野，前后对比差异有统计学意义(t=13．108，P<0．001)。从形态上看，PH形成后的外周血EPCs所形成血管在质量上和复杂程度上都差于基础时外周血EPCs。5、EPCs移植后肺血流动力学变化EPCs移植后4周，C组mPAP由19．4±1．95 mmHg继续增高至28．6+3．05mmHg(t=15．778，P<0．001)，而T组mPAP由19．3±2．25 mmHg降至16．2±5．78mmHg(t=1．172，P=0．294)。在10周末T组的mPAP显著低于C组(t=4．312，P=0．002)。在10周末T组的TPVR显著低于C组(3．99±1．07对7．75±1．29，t=5．292，P<0．001)。6、EPCs移植后内皮素变化在PH形成后，未经EPCs移植的C组血清内皮素水平继续增高，由6周末的0．47±0．04 pg／ml增高到10周末的0．53±0．03pg／ml(t=2．851，P=0．046)，而T组在EPCs移植治疗前后内皮素水平无变化(0．42±0．05 pg／ml对0．41±0．09pg/ml，t=0．357，P=0．736)。但在10周末T组的内皮素水平低于C组(t=2．885，P=0．018)。7、组织学观察正常对照犬的肺组织外观鲜红，颜色均匀；而注射DHMC犬的肺组织整体色泽稍暗，在肺叶外侧可见呈条状、片状的色泽发白暗红甚至发黑区域。光镜下可见肺小动脉中膜增厚，管腔狭窄。S组的肺肌性动脉的中膜厚度百分比为(8．4±3.2)％，C组为(17．2±5．3)％，T组为(14．2±5．2)％。三组之间差异有统计学意义(F=8．952，P=0．001)。尽管数值上T值低于C组，但两两比较T组与C组无统计学差异。光镜下(×40)计数20个视野，T组的毛细血管密度为305±35／20视野，C组为284±34／20视野，无统计学差异(t=0．828，P=0．429)。右心室肥大指数三组间无统计学差异(F=1．369，P=0．298)。8、EPCs示踪经Dil染色的EPCs移植后4周末处死动物行肺组织冰冻切片，在荧光显微镜下未发现有呈现红色荧光的细胞。MRI检查均未发现肺组织或动物身体其他部位呈现见异常的低信号改变。【结论】1．DHMC诱导模型犬的肺动脉压力增高、总肺循环阻力增高、小肺动脉中膜增厚，内皮素水平增高，证明建立了稳定可靠的慢性PH模型。2．PH形成后外周血分离培养的EPCs数量下降，粘附迁移能力受损，成血管能力下降。3．自体EPCs移植可改善PH犬的肺血流动力学。4．移植的EPCs可能通过旁分泌提高血管内皮细胞的增殖、迁移和分化能力，改善内皮功能而起治疗作用。