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细胞的正常生命活动涉及到各种蛋白质翻译后修饰方式的调控,这些修饰能调节蛋白质生物学功能及细胞信号网络。虽然这并不改变蛋白质合成和降解的速度,但可能影响蛋白质的功能,因此增加了蛋白质功能研究的复杂性。蛋白质翻译后修饰的方式和形式有很多种。SUMO (small ubiquitin-related modifier,小泛素相关修饰物)是一类结构与泛素类似的小分子修饰物(Ubls)。目前,在哺乳动物中已存在SUMO-1, SUMO-2, SUMO-3和SUMO-4四种SUMO分子。SUMO-1则是一种分子量约12 KDa,在真核生物中广泛存在SUMO分子。通过E1、E2以及E3酶的催化作用,与底物蛋白相结合而起作用。这一特异性的结合过程叫做SUMO化(SUMOylation). SUMO化作为一种动态可逆的蛋白翻译后修饰方式之一,能被SUMO特异性蛋白酶(SENP)所逆转,这一动态平衡参与调控真核细胞多种生物学过程,如细胞周期,细胞凋亡,细胞增殖和分化、两种或多种蛋白质之间的相互作用,信号传导,调节靶蛋白分子的细胞定位／转运、稳定性、转录活性和生物学活性等等。在哺乳动物中,增殖和分化的卵巢颗粒细胞对卵泡发育以及卵子发生过程起重要调控作用。目前,关于SUMO-1在颗粒细胞中的作用和功能还不是很明确。因此本研究的主要目的是通过研究SUMO-1、UBC9在卵巢中的定位和表达模式,探讨其在卵巢颗粒细胞中的作用,揭示SUMO-1及UBC9对卵巢颗粒细胞周期、增殖和凋亡过程的调节作用,同时鉴定未知的SUMO-1靶蛋白及对细胞调控的研究,为进一步理解卵巢多种生理生化过程的调节机制提供重要的理论依据。本研究以小鼠为实验动物,PMSG/hCG注射小鼠,不同时间段取小鼠卵巢样本,应用Western blotting和免疫组化方法检测SUMO-1和UBC9在不同发育阶段的卵泡中的表达和定位模式。另外,用PCR方法构建pCMV-N-HA/Flag-SUMO1/UBC9, pCMV-N-Flag-SUMO1G96-97A, pEGFP-C1-SUMO1/UBC9, pCMV-N-HA-PTX3以及pCMV-N-HA-PTX3K203R8种真核表达载体。体外培养的小鼠卵巢颗粒细胞作为研究对象,将各种过表达载体转染至细胞中,通过免疫细胞化学法,检测SUMO-1/UBC9/PTX3蛋白在细胞中的分布和定位。用流式细胞仪和酶标仪检测SUMO-1及UBC9在卵巢颗粒细胞的细胞周期、细胞凋亡、细胞增殖等过程中的调节作用及其调节机制,揭示其参与的特定过程。同时,通过免疫印迹和免疫共沉淀的方法验证PTX3是否能被SUMO-1修饰以及鉴定出被修饰的主要位点。这些初步的研究,为后续研究SUMO-1蛋白的修饰作用打下了坚实的基础。研究结果如下：(1)成功构建pCMV-N-HA/Flag-SUMO1/UBC9, pCMV-N-Flag-SUMO1G96-97A, pEGFP-C 1-SUMO 1/UBC9, pCMV-N-HA-PTX3以及pCMV-N-HA-PTX3K203R真核表达载体；(2) Western blotting实验表明,内源性的SUMO-1、UBC9在不同发育时期的小鼠卵巢组织中,在34,43和72 KDa有高分子量的复合物蛋白的表达,表达模式也不同。PMSG处理后,SUMO-1在34/43 KDa处,1h时显著升高,12/24 h时最低,36 h后又升高(P<0.001)。-72 KDa处和总蛋白,在12/24/36 h时降低,48 h后增加(P<0.001)。hCG处理后,34/43 KDa处,9/11 h时表达增加,7/15 h时较低(P<0.001)。72 KDa处变化不明显。总蛋白11h和24 h时有所上升(P<0.001)。同时,PMSG处理后,UBC9在34/43 KDa处24/36/48 h时表达量升高(P<0.001),总蛋白48 h最高(P<0.001)。hCG处理后,11h最低(P<0.001)。总蛋白差异不大。说明SUMO-1、UBC9的特异性表达受生殖激素调控,可能同卵泡生长发育相关,并且可能参与调控卵泡发育,卵母细胞成熟和颗粒细胞发育的生理过程；同时,体外培养的颗粒细胞也表现出不同的SUMO-1、UBC9表达模式,48 h时的表达量明显较高(P<0.05);(3)免疫组织化学结果表明,在8,10天的小鼠初级和次级卵泡中发现SUMO-1、UBC9很强的阳性信号,主要分布在卵母细胞核和颗粒细胞中,PMSG处理后在各个时期的卵母细胞和颗粒细胞中都有信号,差异不明显。然而,在12h的时候很强。hCG处理后主要定位在有腔卵泡和排卵前卵泡中,同时在黄体细胞中也能观察到阳性信号；(4)将SUMO-1、UBC9过表达载体成功转染至小鼠卵巢颗粒细胞,间接免疫荧光结果表明,SUMO-1和UBC9蛋白在颗粒细胞核中存在特异性表达和定位,当SUMO-1的G96-97两个活性氨基酸位点发生突变后,在细胞核和细胞质中都能检测到定位,这些结果说明G96-97A能影响SUMO-1在颗粒细胞中的定位,SUMO-1可能在细胞核中发生重要的作用；(5)检测到SUMO-1、UBC9的过表达和突变对颗粒细胞周期、凋亡以及增殖的影响,结果发现,SUMO-1、UBC9细胞周期的S期略有降低,但是差异不显著(P>0.05),细胞增殖实验表明,SUMO-1和UBC9在一定程度上能促进颗粒细胞的增殖(P<0.001),过表达SUMO-1、UBC9后显著促进颗粒细胞的凋亡,G96-97突变后,细胞凋亡更加明显(P<0.001),这说明SUMO-1和SUMO化能介导颗粒细胞的凋亡;(6)免疫印迹和免疫共沉淀分析表明,PTX3能被SUMO-1修饰,同时鉴定lys203是其SUMO化修饰位点。当lys203位点发生突变时,显著降低了PTX3的SUMO-1修饰程度,表明lys203是关键的SUMO-1修饰位点。研究表明,内源的PTX3主要定位在颗粒细胞的细胞质中,过表达的PTX3定位在胞质和胞核中,然而,K203R突变后,仅仅定位在细胞核中,我们推测,lys203是PTX3被SUMO-1修饰后,使其在细胞质中定位的关键点,可能涉及到PTX3从细胞质分泌到细胞外基质的过程,对卵丘细胞外基质的形成有重要的作用。本研究主要证实了,SUMO-1及UBC9在不同发育时期小鼠卵巢组织中具有特异性的时间和空间表达模式,其表达水平受生殖激素的调控,且呈时间依赖性趋势；SUMO-1、UBC9在不同发育时期的卵泡、颗粒细胞以及黄体细胞中有定位,主要定位在颗粒细胞核中,当SUMO-1的96-97位甘氨酸突变后,其定位模式发生改变；SUMO-1、UBC9的过表达和突变对颗粒细胞周期有一定程度的影响,同时促进细胞的增殖以及凋亡;鉴定出一种新的SUMO-1修饰蛋白—PTX3, lys203是其SUMO化位点,且当此位点突变时,在颗粒细胞中的定位发生改变。