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亚硝酸乙酯（Ethyl nitrite/O-nitrosoethanol,ENO）,是一种广泛存在于食品中的有机物,也是有机化学工艺中常见的中间产物。尽管人们对它的认识已有百余年的历史,但其在医学方面的研究却极少报道。ENO作为一个古老的有机化合物,它引起医学科研工作者的注意与一氧化氮（nitric oxide,NO）在医学方面的研究进展有着极大的关联。 1992年Kinsellla等首次报道吸入NO（inhaled nitric oxide,iNO）治疗新生儿持续性肺动脉高压（persistent pulmonary hypertension of the newborn,PPHN）取得良好临床效果,此后iNO逐渐成为医学研究的一个热点。尽管大量的临床和实验研究都提示了iNO在治疗肺动脉高压和急性肺损伤的中的良好疗效,这些研究同时也发现了iNO的诸多副作用,其中犹为突出的两个毒副作用是:1、NO易与氧及超氧阴离子（O2/O2-）反应形成有害的氮氧化合物（NOx）,后者可通过髓过氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）作用等氧化途径使蛋白硝基化及造成氧化应激损害等;2、NO吸入的中止常引起肺动脉高压的“返跳”（rebound）现象。 与吸入NO不同的是,内源性NO产生后,除通过与血管内皮细胞的作用直接调节血管扩张外,另有部分可共价结合硫醇如谷胱甘肽、半胱氨酸和血红蛋白等,发生亚硝化反应以亚硝基硫醇（S-Nitrosothiols,SNOs）的形式贮存于细胞内。人体内SNOs主要包括亚硝酰基谷胱甘肽（S-nitrosoglutathione,GSNO）、浙江大学硕士学位论文亚硝酞基半肤氨酸（S一nitrosoeysteine,CsNO）及亚硝酞基血红蛋白（s一nitrosohemoglobin,SNO一Hb）等。sNOs的形成,既避免T NO与02/02‘的结合,又可随血循环氧饱和度的高低及组织中O:梯度变化来调节NO水平从而发挥调节血管张力的作用。 为了模拟内源性NO的特性,Duke大学的Stamler教授领导的小组筛选出了ENO这种有机物。由于ENO的沸点低（17℃）常温下能气化,因此其可作为一种候选气体用作吸入研究。ENO的基本特性是在O:存在下不易降解（在100%O:中稳定）、能与谷肤甘肤反应生成GSNO、不易对血红蛋白氧化及有很好的生物兼容性。对于ENO的初步研究发现,腹腔境手术过程中用ENO混合COZ吹入腹腔,可显著减轻手术过程中腹腔脏器血流的减少,显示了ENO可选择性扩张血管的作用;而用ENO吸入治疗肺动脉高压,也显示了其有选择性扩张肺血管及改善氧合的作用,与传统的一氧化氮吸入治疗相比,它无明显的“返跳”现象及毒性产物（如NO、）产生。这些初步研究成果提示ENO将可能成为继NO’后吸入治疗的新的研究方向。 由于ENO在医学方面的研究尚处于起步阶段,不管是动物或临床实验中,其应用的适宜剂量及毒性作用均无明确报道,所以本课题拟用细胞培养的方法,通过研究不同浓度不同作用时间ENO对V79细胞生存率的影响,以了解ENO的细胞毒性作用;并通过研究增加/消耗还原型谷肤甘肤（GSH）对ENO细胞毒性的影响及ENO对细胞凋亡影响来探讨ENO产生毒性作用的可能机制。我们期望通过本课题的研究,为今后实验中ENO应用剂量的选择提供依据,并为进一步研究其毒性提供思路。第一部分亚稍酸乙醋的细胞毒性作用研究目的: 研究不同浓度不用作用时间ENO对V79细胞生存率的影响,探讨ENO可能存在的细胞毒性作用。浙江大学硕士学位论文方法:l、ENO的合成、提纯和纯度测定: 合成:常温下,浓硫酸缓慢滴定亚硝酸钠、乙醇和水的混合溶液,产生气体 经冷凝后收集。 提纯:制得的液体状态ENO室温下经反复气化冷凝而纯化。 纯度测定:气相色谱法。2、细胞培养:常规细胞培养。3、MTT法研究不同浓度不同作用时间ENO对V79细胞生存率的影响（重复3次）。 研究6个ENO浓度0、0.0001%、0.0005%、0.0025%、0.0125%、0.0625%作用4h、sh、12h、24h对V79细胞生存率的影响,同时设空白对照组,以该组生存率为100%。4、乳酸脱氢酶法进一步确定0.0125%ENO作用4h的毒性作用。 设空白对照组:单加培养基作用4h; 对照组:加含l%乙醇的培养基作用4h; ENO组:加含0.0125%的ENO处理4h。结果:I、ENO测定结果:ENO+乙醇99.7337%。2、MTT结果: （1）、不同浓度ENO对细胞生存率影响 作用4h时,0.0125%和0.0625%组与0浓度组比较生存率均显著下降（P<0.01）,0.0625%组较0.0125%组生存率更进一步下降（p<0.01）;作用sh、12h和24h时,0.0025%、0.0125%和0.0625%组较0浓度组生存率均显著下降 （P<0 .01）,该三组间随浓度增加生存率逐渐下降（P均<0.01）。 （2）、不同时间对细胞生存率的影响 O、0.0001%和0.0005%组,24h内各时间点无显著差异;0.0025%组,sh浙江大学硕士学位论文 生存率较4h显著下降（P<0.05）,12h和sh无显著差异,24h较12h生存率更 进一步下降（P<0.01）;0.0125%组,8h生存率较4h显著下降（P<0 .01）,12h 和8h无显著差异,24h较12h生存率更进一步下降（P<0 .01）;0.0625%组8h 较4h生存率显著下降（P<0.01）,12h较sh生存率更进一步下降（P<0.01）,24h 和12h无显著差异。 3、LDH结果:0.0125%ENO作用4h后培养上清LDH显著增高（P<0.05）。 结论: 1、成功合成并提纯ENO。 2、ENO具有一定细胞毒性,其毒性具有一定的浓度依赖性和时间依赖性。一 次性给予0.0125%的E