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背景与目的急性髓性白血病(Acute myeloid Leukemia,AML)是起源于骨髓造血干细胞的恶性疾病,约占成人急性白血病(Acute Leukemia,AL)的80%。近年来,随着联合化疗和异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)的不断发展明显改善了 AML病人的疗效,患者的完全缓解(complete remission,CR)率和无病生存率(disease free survival,DFS)都显著提高,但仍然有15%～25%的患者对化疗或者免疫治疗抵抗,超过60%的患者最终复发死亡。AML难治复发的根本原因是白血病干细胞(Leukemic stem cells,LSCs)的存在,LSCs对常规化疗药物耐药且对allo-HSCT后起关键杀伤作用的同种异体反应性自然杀伤细胞(allo-reactionNK,allo-NK)抵抗,残存的LSCs最终导致AML复发。因此,我们迫切需要新的治疗方法逆转LSCs的耐药和对allo-NK细胞杀伤抵抗,清除LSCs,最终治愈AML。Allo-NK细胞是机体固有免疫系统的主要成分之一,通过表达活化性受体和抑制性受体来识别异常和正常组织细胞。allo-NK细胞对包括白血病在内的多种肿瘤细胞,均有杀伤作用。NK细胞通过其表面的NKG2D和肿瘤细胞表面表达的NKG2D配体结合而激活,激活后的NK细胞能分泌穿孔素和颗粒酶来溶解肿瘤细胞;同时Allo-NK细胞表面表达的TRAIL和FasL,能和肿瘤细胞表面的DR4/5以及Fas结合,通过外源性凋亡途径诱导肿瘤细胞凋亡。allo-NK细胞对白血病细胞的杀伤活性受NKG2DL表达水平的影响,而白血病细胞通过不表达或低表达NKG2DL逃避NK细胞的杀伤。因此,有可能通过调节免疫激活物在LSCs的表达增强其被allo-NK杀伤的作用。LSCs存在多个信号通路异常,其中PI3K/AKT及NF-κB在导致LSCs凋亡抵抗及逃逸免疫治疗中起重要作用。手霉素(Manumycin,Manu)是链霉菌产生的天然抗生素,对多种肿瘤细胞有杀伤作用。我们前期的研究发现Manu能诱导NO产生,并通过线粒体凋亡途径诱导白血病细胞。手霉素可部分诱导LSCs凋亡,并能通过上调NKG2D配体恢复LSCs被allo-NK细胞杀伤的敏感性。但手霉素对LSCs的确切作用和机制尚不清楚。因此,本研究拟利用自建的LSC模型和分选自复发AML病人的LSCs,测定手霉素处理前后LSCs细胞活性,ROS生成及细胞凋亡情况,检测手霉素对LSCs表达NKG2DL及PI3K/AKT和NF-κB的影响,探讨ROS和PI3K/AKT/NF-κB在手霉素调控LSCs表达免疫激活物中的作用,旨在阐明手霉素调控LSCs表达免疫激活物的作用及其机制,为有效激活allo-NK细胞清除LSCs提供新靶点。方法第一章Manu提高LSCs被allo-NK细胞杀伤的敏感性1.从KGla细胞株分选CD34+CD38-LSCs及纯度检测;2.从健康人外周血分出单个核细胞,加入人IL-2、L-15诱导allo-NK细胞形成;3.LDH法检测Manu对allo-NK细胞杀伤KGla细胞株分选出LSCs的作用;第二章Manu诱导LSCs凋亡及ROS生成流式细胞术分别检测Manu对LSCs凋亡和ROS生成的影响。第三章Manu上调死亡受体DR5,下调PI3K/AKT/NF-KB在LSCs的表达l.Western-blot法检测Manu干预后LSCs中外源性凋亡通路中关键蛋白DR5的表达情况。2.Western-blot法检测Manu干预后LSCs中PI3K/AKT/NF-κB信号通路的关键蛋白 PI3K,p-PI3K,AKT,p-AKT,NF-κB 的表达情况。第四章Manu提高LSCs被allo-NK细胞杀伤需ROS的参与1.流式细胞术检测NAC对Manu诱导LSCs产生ROS的抑制作用。2.Western-blot 法检测 NAC 对 Manu 调控 LSCs 表达 DR5、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT,NF-κB等蛋白的影响。3.流式细胞术检测NAC对LSCs细胞表达ULBP3和MICA/B的影响。4.LDH法检测NAC对Manu增强LSCs细胞被allo-NK细胞杀伤的影响。5.LDH法检测阻断LSCs表面NKG2DL与allo-NK表面NKG2D结合后allo-NK对LSCs杀伤的影响。结果第一章Manu提高LSCs被allo-NK细胞杀伤的敏感性1.从KGla细胞株分选LSCs及纯度检测从KGla细胞株分选出CD34+CD38-型LSCs;流式结果显示CD34+CD38-型LSCs占96%以上。2.成功分离allo-NK细胞从健康人的外周血中分离出单个核细胞,加入人IL-2、L-15诱导allo-NK细胞形成。发现allo-NK增殖速度较快,细胞呈圆形小而透亮,成团样聚集生长。3.Manu提高LSCs对allo-NK细胞杀伤的敏感性LDH检测结果显示:与对照组及allo-NK细胞组相比,Manu+allo-NK细胞组的杀伤率明显增加,各组的杀伤率分别为:0.73±0.26%、1.77±0.46%、76.68±14.44%、103.79±9.10%,各组间差异有统计学意义(F=113.691,P<0.05)。与NK细胞组相比,Manu+NK组的杀伤率明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)。第二章Manu诱导LSCs凋亡及ROS生成1.Manu诱导LSCs凋亡流式结果显示Manu作用于LSCs 6h即开始出现凋亡,且随着时间的延长,LSCs的凋亡率逐渐升高,时间点Oh、6h、12h、18h、24h凋亡率的差别有统计学意义(F=4.251,P=0.029)。2.Manu诱导白血病干细胞ROS生成流式结果表明Manu作用于LSCs 3h即开始出现明显的ROS生成,3h、6h、12hROS的生成与Oh相比,差异有统计学意义(F=102.187,P=0.00)。第三章Manu上调死亡受体DR5,下调PI3K/AKT/NF-κB在LSCs的表达1.手霉素上调DR5在LSCs的表达Manu处理LSCs后,Western-blot检测DR5的表达情况。结果显示:Manu上调LSCs中DR5的表达且随作用时间的延长DR5表达量增加。2.手霉素下调PI3k/Akt/NF-κB在LSCs的表达Manu干预LSCs后Western-blot检测相关蛋白的表达情况。结果显示:Manu下调 PI3K、P-PI3K、AKT、p-AKT、NF-κB 等蛋白的表达。第四章Manu提高LSCs被allo-NK细胞杀伤需ROS的参与1.NAC阻断Manu诱导的LSCs生成ROS和凋亡流式结果显示NAC本省不影响LSCs生成ROS的凋亡,但NAC可明显阻断Manu诱导LSCs生成ROS和凋亡。各组间ROS生成及凋亡的差异有统计学意义(F=19.79,P=0.00;F=695.36,P=0.00)。结果提示:Manu 诱导 LSCs 凋亡需要ROS参与。2.NAC抑制Manu下调LSCs表达PI3K/AKT/NF-κB等蛋白结果显示 NAC 本身不影响 LSCs 的 PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT,NF-κB等蛋白的表达,但NAC阻断Manu下调LSCs中PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT,NF-κB等蛋白的表达,提示ROS生成处于PBK/AKT/NF-κB信号通路上游。3.NAC抑制Manu上调LSCs中死亡受体DR5的表达结果显示NAC本身不影响LSCS的DR5蛋白表达,但NAC可抑制Manu上调LSCs中DR5的表达。4.NAC 抑制 Manu 上调 LSCsNKG2D 配体(ULBP3 和 MICA/B)的表达流式结果显示Manu明显上调LSCs表面ULBP3和MICA/B的表达,NAC本身不影响ULBP3和MICA/B的表达。NAC抑制Manu上调LSCsNKG2D配体(ULBP3和MICA/B)的表达。5.NAC抑制Manu增强LSCs被allo-NK细胞杀伤的影响。LDH结果显示Manu增强了 LSCs被allo-NK细胞杀伤的敏感性,而NAC抑制了 Manu增强LSCs被allo-NK杀伤的敏感性。6.阻断LSCs表面NKG2DL与allo-NK表面NKG2D结合后LSCs可逃避allo-NK细胞介导的杀伤。LDH结果显示:以人NKG2D Fc嵌合体阻断LSCs表面NKG2DL与allo-NK细胞表面NKG2D的结合后,Manu对allo-NK杀伤LSCs的增敏作用明显减弱。结论1.Manu提高LSCs被allo-NK细胞杀伤的敏感性。2.Manu可诱导LSCs的ROS生成和凋亡。3.Manu可下调PI3K/AKT/NF-κB蛋白的表达,上调LSCs表达DR5,激活外源性凋亡通路。4.Manu诱导LSCs生成ROS,且ROS处于PI3K/AKT/NF-KB信号通路和外源性凋亡通路的上游。5.Manu通过上调LSCs表面的NKG2DL而增强LSCs被allo-NK细胞杀伤。6.Manu通过诱导ROS生成逆转白血病干细胞对allo-NK细胞的杀伤抵抗。