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目的肺成纤维细胞是肺脏疏松结缔组织中主要细胞之一。它在生理状态下可维持肺脏组织正常形态,能及时修复损伤组织。病理状态下肺脏成纤维细胞通过自身异常增殖、转型和合成分泌大量细胞外基质等功能改变参与特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)的形成过程。转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)可诱导成纤维细胞活化,是致纤维化最为关键的细胞因子之一,故探究有效方法及手段干预TGF-β1介导的肺成纤维细胞活化过程,有希望成为治疗肺纤维化的新策略。羟基红花黄色素A(Hydroxysafflor yellow A,HSYA)是从传统活血化瘀中药红花中分离的水溶性化合物,具有抗炎、抗氧化、抗血小板聚集、保护心肌等作用,HSYA抗肝、肾纤维化的研究已有报道。我们课题组在前期研究中发现:HSYA能有效缓解博莱霉素诱发的大鼠和小鼠肺纤维化;缓解烟熏-脂多糖诱发慢阻肺大鼠晚期肺纤维化;抑制脂多糖诱发的急性呼吸窘迫综合症小鼠肺部纤维化相关因子的表达;抑制TGF-β1诱导人肺癌细胞A549上皮间质转化。但HSYA是否能够直接抑制TGF-β1诱导下肺成纤维细胞的活化,其具体作用靶点及机制,除我们研究室之外,目前尚无研究报道。因此,本研究主要探讨HSYA对TGF-β1所激活的肺成纤维细胞在IPF过程中具有重要意义的一些功能,包括细胞增殖、迁移、表型转化、细胞外基质合成和降解等,探索了其作用靶点与作用机制,为HSYA应用于临床抗IPF治疗提供一定的实验依据和理论支持。方法第一部分:HSYA抑制TGF-β1诱导的肺成纤维细胞活化以人胚肺成纤维细胞MRC-5为研究对象,给予HSYA和/或TGF-β1Ⅰ型受体激酶的抑制剂SB431542预处理,后给予TGF-β1进行诱导,通过MTS[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfo-phenyl)-2H-tet razolium inner salt]法和Ed U(5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷)染色法检测HSYA对TGF-β1作用下细胞增殖的影响,以细胞划痕实验检测HSYA对TGF-β1诱导细胞迁移的影响,Real-time PCR、Western blot和免疫细胞染色检测HSYA对TGF-β1刺激成纤维细胞转化为肌成纤维细胞的标记蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)和细胞外基质的主要成分胶原蛋白Ⅰ(collagenⅠalpha 1,COL1A1)、纤维连接蛋白(fibronectin,FN)的表达变化,采用Western blot法检测HSYA对TGF-β1刺激下成纤维细胞合成调控细胞外基质降解的关键酶基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)、基质金属蛋白酶组织抑制剂1(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1,TIMP-1)和基质金属蛋白酶组织抑制剂2(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-2,TIMP-2)的表达变化,观察HSYA抑制TGF-β1诱发MRC-5功能活化的作用。第二部分:HSYA抑制TGF-β1诱导的肺成纤维细胞活化的机制研究1.以MRC-5细胞为研究对象,给予HSYA和/或TGF-β1Ⅰ型受体激酶的抑制剂SB431542预处理,后给予TGF-β1进行诱导,Western blot检测HSYA抑制TGF-β1诱发的细胞TGF-β1/Smad信号通路主要信号因子Smad2、Smad3磷酸化的作用,采用Western blot和细胞免疫荧光法检测TGF-β1诱导的Smad2/3入核转运,双荧光素酶报告基因法检测HSYA抑制TGF-β1诱发Smad3与胶原蛋白Ⅰ启动子中Smad结合元件(Smad binding element,SBE)结合的作用,以Western blot法检测HSYA抑制TGF-β1诱发细胞外调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)MAPK、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun-N-terminal kinase,JNK)MAPK和p38 MAPK以及PI3K/Akt信号通路主要信号因子Akt磷酸化的作用,探索HSYA抑制TGF-β1诱发MRC-5多种细胞信号转导的作用。2.以MRC-5细胞为研究对象,给予HSYA和/或ERK特异抑制剂PD98059或Smad3特异抑制剂SIS3预处理,后给予TGF-β1进行诱导,初步探讨HSYA对TGF-β1刺激下Smad3和ERK通路间交互作用的影响。第三部分:HSYA抑制TGF-β1诱导成纤维细胞激活作用靶点的探索以MRC-5细胞为研究对象,通过Western blot法检测HSYA对TGF-β1作用下成纤维细胞膜TGF-β1Ⅱ型受体(TGF-β1 typeⅡreceptor,TβRⅡ)和TGF-β1Ⅰ型受体(TGF-β1 typeⅠreceptor,TβRⅠ)蛋白表达的影响。采用流式细胞仪检测HSYA拮抗FITC-TGF-β1与MRC-5细胞受体结合的作用。采用基因沉默的方法沉默细胞膜上TβRⅡ,以下游α-SMA、collagenⅠ、FN的表达水平及Smad2、Smad3、ERK磷酸化为检测指标,观察TβRⅡ被沉默后HSYA药效的变化,以探索其作用靶点。结果第一部分:HSYA能够抑制TGF-β1诱发的MRC-5细胞增殖和迁移。HSYA能降低α-SMA的表达,从而抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞表型的转化。HSYA可以抑制TGF-β1所致MRC-5细胞外基质主要成分COL1A1和FN的表达。另外HSYA对TGF-β1刺激下MRC-5细胞MMP-2、TIMP-1和TIMP-2的表达变化无影响。以上结果表明,HSYA能够抑制TGF-β1所致成纤维细胞活化后主要功能(细胞增殖、迁移、转化及细胞外基质合成)的异常,发挥其抗肺成纤维细胞活化、减轻肺组织重构的作用。第二部分:1.HSYA可以缓解TGF-β1诱发的Smad2、Smad3磷酸化水平的升高与Smad2、Smad3的核转位;HSYA可抑制TGF-β1所致Smad3与COL1A1启动子SBE的结合;HSYA可以抑制TGF-β1诱发的ERK/MAPK蛋白磷酸化水平的升高;TGF-β1未诱发JNK/MAPK、p38 MAPK和Akt磷酸化水平升高,而HSYA也未对其产生影响,以上结果表明,HSYA能够影响TGF-β1介导的Smad通路和ERK/MAPK通路。2.当ERK通路被阻断后,HSYA抑制Smad3磷酸化的药效已不明显,该结果提示,HSYA抑制Smad3磷酸化可能依赖于ERK通路。当Smad3通路被阻断后,HSYA依然可抑制ERK磷酸化,该结果提示,HSYA抑制ERK磷酸化可能不依赖于Smad通路。第三部分:Western blot结果说明,HSYA对TGF-β1诱发的TβRⅡ和TβRⅠ蛋白表达水平变化未产生作用。受体结合实验结果提示,HSYA可拮抗FITC-TGF-β1与MRC-5细胞膜上受体的结合。基因沉默方法沉默细胞膜上TβRⅡ后,TGF-β1-TβRⅡsi RNA组与(TGF-β1+HSYA)-TβRⅡsi RNA组比较,α-SMA、collagenⅠ、FN蛋白表达水平及Smad2、Smad3、ERK磷酸化水平变化的差异无统计学意义,说明TβRⅡ敲低后HSYA的药效已不明显,提示TβRⅡ可能是HSYA抑制细胞α-SMA、collagenⅠ、FN蛋白表达及Smad2、Smad3、ERK磷酸化的作用靶点。结论HSYA可能通过阻断TGF-β1与MRC-5细胞膜上TβRⅡ结合,抑制Smad和ERK通路的信号转导,从而抑制TGF-β1诱发成纤维细胞功能的异常变化,达到抗成纤维细胞活化,缓解肺纤维化的目的。