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在辣椒疫霉侵染寄主的过程中,病原菌能够分泌大量的Rx LR效应分子协同互作来干扰和破坏寄主植物的抗病反应。因此,研究RxLR效应分子基因的功能和蛋白结构,对了解辣椒疫霉的致病机制,有效控制辣椒疫霉的侵染具有重要意义。本项研究以高致病性辣椒疫霉菌株SD33为实验材料,结合相关的研究基础,对辣椒疫霉菌株SD33中RxLR效应分子进行研究,实验结果如下:1、根据JGI辣椒疫霉菌基因组数据库中筛选得到Rx LR效应分子基因核苷酸及氨基酸序列,通过NCBI进行序列比对,确定所要筛选的基因序列。从辣椒疫霉菌株SD33中克隆这些Rx LR效应分子并进行生物信息学分析。2、利用pBIN-GFP2表达载体对辣椒疫霉Rx LR效应分子进行功能研究,在本氏烟中瞬时表达4个候选效应分子,发现其中Rx LR23基因可以诱导本氏烟发生细胞死亡,Rx LR129759可以抑制Bax诱导的细胞死亡。3、为了进一步研究RxLR效应分子的功能,分别将4个RxLR效应分子在本氏烟叶片中瞬时表达并用共聚焦显微镜观察各效应分子的亚细胞定位,发现Rx LR23、Rx LR97196、Rx LR129759均定位在细胞核和细胞质中,Rx LR101012定位在细胞核中。4、根据本实验室之前所得到的效应分子Rx LR23的蛋白质三维结构,对其C末端3个保守W结构域进行不同程度的截短,利用pBIN-GFP2表达载体在本氏烟叶片中瞬时表达各Rx LR23截短体,发现3个W结构域对触发ETI的作用无明显区别。5、效应分子RxLR23在辣椒疫霉菌SD33内的基因敲除。为了进一步研究效应分子Rx LR23在辣椒疫霉SD33中的功能,利用CRISPR/Cas9技术对辣椒疫霉SD33内的Rx LR23进行敲除实验,获得效应分子RxLR23的敲除转化子。对效应分子Rx LR23的敲除转化子进行生物学性状分析和致病性测定。结果表明,敲除Rx LR23使得辣椒疫霉致病能力减弱但其对辣椒疫霉的生长及细胞核在菌丝中的分布没有产生明显的影响。通过本研究,我们发现RxLR效应分子功能具有多样性特点,其中包括诱导细胞死亡及抑制Bax诱导的细胞死亡的功能。不同的效应分子定位在寄主细胞内的不同位置发挥作用。Rx LR23 C末端的3个保守W结构域对于触发ETI没有明显的区别。通过对Rx LR23敲除转化子的致病性测定,转化子致病力下降,这表明在侵染过程中,RxLR23具有毒性功能。这为进一步认识效应分子在病菌侵染过程中的作用提供了理论基础。