论文部分内容阅读
目的：
糖尿病肾病（diabeticnephropathy，DN）是糖尿病最常见的微血管并发症之一，也是导致终末期肾病（end-stagerenaldisease，ESRD）的主要原因，其发病机制十分复杂。许多证据表明对糖尿病肾病进行早期干预可以减缓，甚至逆转糖尿病肾病的进展。研究表明外源性的碱性成纤维细胞生长因子（Basicfibroblastgrowthfactor，bFGF）能够抑制炎症反应，减少氧化损伤，对急慢性肾损伤具有一定的修复作用，并且还可以降低糖尿病大鼠的血糖，血脂和其他指标水平。因此，bFGF在糖尿病肾病的治疗中有着巨大的应用前景。但是由于bFGF具有半衰期短、稳定性差、膜透性差等缺点，在临床上很难得到应用。脂质体（liposome，lip）由天然脂质组成，无毒、可生物降解并且不会对免疫系统产生刺激。用其作为载体，可以提高药物的稳定性，降低药物的毒性，延长药物作用的时间。低频超声（ultrasound，US）与靶向微泡爆破（ultrasoundtargetedmicrobubbledestruction，UTMD）技术相结合能够促进药物向某些器官的特异性递送，并提高靶器官对药物的通透性。有研究证明UTMD技术可以增加早期糖尿病肾病大鼠肾间质毛细血管通透性。因此，本研究将包裹了bFGF的脂质体（bFGF-loadedliposome，bFGF-lip）结合UTMD技术治疗DN大鼠，并探讨其安全性及可能机制，希望能提供一种新的、非侵入性的方法，靶向递送药物，减缓糖尿病肾病病程。
研究方法：
1、通过自主创新的脂质微泡的制备方法，根据已有发明专利的处方以及制备工艺制备脂质微泡，并进行相关的质量评价。
2、采用反相蒸发法制备包载bFGF的脂质体，并进行相关的质量评价。
3、通过腹腔注射链脲佐菌素（STZ）（70mg／kg）建立大鼠糖尿病模型，并在注射后的第3，7，14天尾静脉取血测定血糖浓度，当三次测定结果均大于16.7mmol/L时，可认为糖尿病模型建立成功。4周后，出现微量蛋白尿的造模大鼠即可认为DN模型，并用超声造影（contrast-enhancedultrasound，CEUS）进行检查，寻找能够诊断早期糖尿病肾病的超声参数。DN建模成功后，设置了正常对照组、同等剂量的生理盐水组、单纯UTMD组、单纯bFGF-lip组、单纯bFGF组、bFGF-lip+UTMD组和bFGF+UTMD组。通过对治疗后DN大鼠肾脏体积、血流参数等指标的检测，评价bFGF-lip结合UTMD技术对DN肾功能的影响。通过HE染色来观察各组大鼠肾脏内肾小球和肾小管等病理变化的严重程度；通过测量血清中SOD、MDA的含量来观察大鼠体内氧化应激的程度；另外通过免疫组化、免疫荧光、westernbolt分析来测定大鼠肾脏bFGF、NF-κB、MCP-1、IL-1β、IL-6、TGF-β1、NPHS2、bcl-2、Bax、Caspase-3等蛋白含量，并通过TUNEL染色来检测大鼠肾脏细胞凋亡程度，来证实bFGF-lip结合UTMD技术靶向递送药物的有效性及药物作用机制研究。
结果：
1、本实验制备的bFGF-lip形态圆整，直径为171.1±14.2nm，包封率达79.8±2.6％，Zeta电位为-5.15±2.08mV，并且能够持续释放bFGF，稳定性好，载药量高。
2、从超声造影定量分析中获取时间-强度曲线（time-intensitycurve，TIC）反映的肾脏微循环灌注情况，我们发现与正常大鼠相比，早期DN的大鼠具有更高的TTP和Area值以及更低的A和Grad值。但是，只有A值和Area值的差异具有统计学意义。表明超声参数A和Area可能是反映糖尿病肾病早期血流变化的敏感指标。
3、经过药物干预8周后，相比糖尿病组及其他各个干预组大鼠，bFGF-lip结合UTMD技术干预组能显著改善糖尿病大鼠的肾功能（P<0.05）。WB结果显示UTMD技术能够显著增加大鼠肾脏中bFGF的含量。HE染色结果显示，DN组肾小球系膜细胞增生和基底膜增厚，而使用bFGF-lip+UTMD干预治疗能够显著缓解这些病理性肾损伤。免疫组化、免疫荧光、TUNEL染色及WB等结果显示，bFGF-lip+UTMD干预治疗能明显减少体内炎症反应和氧化应激反应，减少肾小管上皮细胞凋亡及足细胞损伤，延缓糖尿病肾病的进展。
结论：
本研究表明CEUS定量分析对早期糖尿病肾病的诊断具有良好的价值。此外，bFGF可能通过抑制NF-κB的活化来延缓糖尿病肾病的进展，从而减少促炎细胞因子TGF-β1、MCP-1、IL-6和IL-1β的表达，来减少氧化应激反应，肾小管上皮细胞凋亡和足细胞损伤。此外，bFGF脂质体联合UTMD技术能够更好地发挥bFGF对糖尿病大鼠DN的治疗作用，这可能是由于更多的bFGF被递送到肾脏。该方法未来可能用于在临床上靶向递送药物治疗DN。
糖尿病肾病（diabeticnephropathy，DN）是糖尿病最常见的微血管并发症之一，也是导致终末期肾病（end-stagerenaldisease，ESRD）的主要原因，其发病机制十分复杂。许多证据表明对糖尿病肾病进行早期干预可以减缓，甚至逆转糖尿病肾病的进展。研究表明外源性的碱性成纤维细胞生长因子（Basicfibroblastgrowthfactor，bFGF）能够抑制炎症反应，减少氧化损伤，对急慢性肾损伤具有一定的修复作用，并且还可以降低糖尿病大鼠的血糖，血脂和其他指标水平。因此，bFGF在糖尿病肾病的治疗中有着巨大的应用前景。但是由于bFGF具有半衰期短、稳定性差、膜透性差等缺点，在临床上很难得到应用。脂质体（liposome，lip）由天然脂质组成，无毒、可生物降解并且不会对免疫系统产生刺激。用其作为载体，可以提高药物的稳定性，降低药物的毒性，延长药物作用的时间。低频超声（ultrasound，US）与靶向微泡爆破（ultrasoundtargetedmicrobubbledestruction，UTMD）技术相结合能够促进药物向某些器官的特异性递送，并提高靶器官对药物的通透性。有研究证明UTMD技术可以增加早期糖尿病肾病大鼠肾间质毛细血管通透性。因此，本研究将包裹了bFGF的脂质体（bFGF-loadedliposome，bFGF-lip）结合UTMD技术治疗DN大鼠，并探讨其安全性及可能机制，希望能提供一种新的、非侵入性的方法，靶向递送药物，减缓糖尿病肾病病程。
研究方法：
1、通过自主创新的脂质微泡的制备方法，根据已有发明专利的处方以及制备工艺制备脂质微泡，并进行相关的质量评价。
2、采用反相蒸发法制备包载bFGF的脂质体，并进行相关的质量评价。
3、通过腹腔注射链脲佐菌素（STZ）（70mg／kg）建立大鼠糖尿病模型，并在注射后的第3，7，14天尾静脉取血测定血糖浓度，当三次测定结果均大于16.7mmol/L时，可认为糖尿病模型建立成功。4周后，出现微量蛋白尿的造模大鼠即可认为DN模型，并用超声造影（contrast-enhancedultrasound，CEUS）进行检查，寻找能够诊断早期糖尿病肾病的超声参数。DN建模成功后，设置了正常对照组、同等剂量的生理盐水组、单纯UTMD组、单纯bFGF-lip组、单纯bFGF组、bFGF-lip+UTMD组和bFGF+UTMD组。通过对治疗后DN大鼠肾脏体积、血流参数等指标的检测，评价bFGF-lip结合UTMD技术对DN肾功能的影响。通过HE染色来观察各组大鼠肾脏内肾小球和肾小管等病理变化的严重程度；通过测量血清中SOD、MDA的含量来观察大鼠体内氧化应激的程度；另外通过免疫组化、免疫荧光、westernbolt分析来测定大鼠肾脏bFGF、NF-κB、MCP-1、IL-1β、IL-6、TGF-β1、NPHS2、bcl-2、Bax、Caspase-3等蛋白含量，并通过TUNEL染色来检测大鼠肾脏细胞凋亡程度，来证实bFGF-lip结合UTMD技术靶向递送药物的有效性及药物作用机制研究。
结果：
1、本实验制备的bFGF-lip形态圆整，直径为171.1±14.2nm，包封率达79.8±2.6％，Zeta电位为-5.15±2.08mV，并且能够持续释放bFGF，稳定性好，载药量高。
2、从超声造影定量分析中获取时间-强度曲线（time-intensitycurve，TIC）反映的肾脏微循环灌注情况，我们发现与正常大鼠相比，早期DN的大鼠具有更高的TTP和Area值以及更低的A和Grad值。但是，只有A值和Area值的差异具有统计学意义。表明超声参数A和Area可能是反映糖尿病肾病早期血流变化的敏感指标。
3、经过药物干预8周后，相比糖尿病组及其他各个干预组大鼠，bFGF-lip结合UTMD技术干预组能显著改善糖尿病大鼠的肾功能（P<0.05）。WB结果显示UTMD技术能够显著增加大鼠肾脏中bFGF的含量。HE染色结果显示，DN组肾小球系膜细胞增生和基底膜增厚，而使用bFGF-lip+UTMD干预治疗能够显著缓解这些病理性肾损伤。免疫组化、免疫荧光、TUNEL染色及WB等结果显示，bFGF-lip+UTMD干预治疗能明显减少体内炎症反应和氧化应激反应，减少肾小管上皮细胞凋亡及足细胞损伤，延缓糖尿病肾病的进展。
结论：
本研究表明CEUS定量分析对早期糖尿病肾病的诊断具有良好的价值。此外，bFGF可能通过抑制NF-κB的活化来延缓糖尿病肾病的进展，从而减少促炎细胞因子TGF-β1、MCP-1、IL-6和IL-1β的表达，来减少氧化应激反应，肾小管上皮细胞凋亡和足细胞损伤。此外，bFGF脂质体联合UTMD技术能够更好地发挥bFGF对糖尿病大鼠DN的治疗作用，这可能是由于更多的bFGF被递送到肾脏。该方法未来可能用于在临床上靶向递送药物治疗DN。