恶性肿瘤是严重危害人类健康的主要疾病之一。目前主要的治疗方法包括手术、化疗和放疗等，但其毒副作用大，疗效差。因此，寻找毒副作用小、安全、高效的肿瘤治疗方法是目前肿瘤研究的重要趋势。熊果酸（Ursolic acid，UA）是存在于天然植物中的一种五环三萜类化合物，具有多种生物学功效。近年来研究发现熊果酸具有抗肿瘤及增强机体免疫功能作用。目前，其具体的抗肿瘤作用机制并不明确。本文研究了熊果酸体外抗肿瘤作用机制，体内肿瘤免疫调节作用及作为佐剂的肿瘤免疫预防作用，为熊果酸在抗肿瘤领域深入的应用开发提供可靠的实验依据。论文主要研究内容及结论如下：1.熊果酸对宫颈癌细胞体外增殖抑制及诱导凋亡作用研究目的探讨熊果酸对体外培养宫颈癌细胞的增殖抑制及诱导凋亡的作用。方法MTT法测定熊果酸对HeLa细胞增殖的影响；流式细胞术分析熊果酸作用HeLa细胞后细胞周期的变化及细胞凋亡情况；Western blot检测熊果酸作用HeLa细胞后caspase-3，caspase-8，caspase-9，cytochrome c，Bcl-2，Bcl-xL，Bak，Bax蛋白表达。Real-time PCR检测了熊果酸对宫颈癌HeLa和Siha细胞中HPV E6和E7基因的表达。结果熊果酸抑制HeLa细胞增殖呈浓度依赖性，40μM熊果酸作用48h后细胞增殖抑制率高达91.80±3.26%，IC50值为9.54±3.51μM。流式细胞术测定结果显示熊果酸阻滞HeLa细胞周期在G0/G1期，40μM作用48h效果最显著。熊果酸诱导HeLa细胞凋亡呈浓度依赖性，40μM和60μM作用48h后，细胞早期凋亡率分别为74.30±5.26%和83.87±2.27%，显著高于对照组2.20±1.15%(P<0.01)。Western blot结果显示UA作用HeLa细胞引起caspase-3和caspase-9激活，可观察到剪切形式的caspase-3和caspase-9出现；细胞质中cytochrome c蛋白表达量增加；Bcl-2和Bcl-xL蛋白表达水平降低，Bax和Bak蛋白表达水平增加，均呈一定的时间依赖性。Procaspase-8蛋白表达量也降低，但未检测到剪切形式的caspase-8条带。Real-time PCR结果显示宫颈癌HeLa和SiHa细胞中HPV E6基因的表达量均显著降低（P<0.01），E7基因的表达未出现显著性改变。表明，熊果酸在体外对宫颈癌细胞有较好的增殖抑制活性，可以通过诱导细胞凋亡达到体外抗肿瘤作用，对其抗凋亡途径的研究表明UA可以通过线粒体途径诱导宫颈癌细胞凋亡。UA抗宫颈癌的靶点可能在于能够抑制HPV病毒E6基因的表达和促进细胞凋亡的发生。2.熊果酸诱导HeLa细胞凋亡中MAPK信号通路作用及细胞因子的变化目的熊果酸诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制并不清楚。本文探讨了MAPK信号通路在熊果酸诱导HeLa细胞凋亡中的作用及细胞凋亡中细胞因子变化。方法Western blot检测了不同浓度熊果酸作用HeLa细胞48h后MAPK信号通路中p38，p-p38，ERK，p-ERK，JNK，p-JNK蛋白的表达； ERK1/2抑制子U0126对ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表达的影响和p38抑制子SB203580对p38，p-p38蛋白表达的影响；U0126和SB203580对细胞凋亡相关Bax、Bcl-2、caspase-3、cytochrome c蛋白表达的影响；Real-time PCR检测了熊果酸对DUSP基因表达的影响；ELISA检测熊果酸作用HeLa细胞培养液中IL-2、IL-4细胞因子含量。结果熊果酸降低p-ERK1/2和p-p38蛋白的表达，呈浓度依赖性，对p-JNK蛋白的表达无改变；ERK1/2抑制子U0126显著增强熊果酸诱导Bax/Bcl-2比率与熊果酸组比较（P<0.05），增强线粒体cytochrome c的释放和剪切的Caspase-3蛋白的表达；p38抑制子SB203580作用效果不明显。Real-time PCR结果显示熊果酸增强DUSP1,2,4,5,6,7,9,10基因的表达。ELISA结果显示熊果酸改变细胞培养液中细胞因子的分泌但无规律性。表明，ERK1/2信号通路参与熊果酸诱导的细胞凋亡，熊果酸可能通过增强DUSPs基因表达，抑制ERK1/2和p38磷酸化来诱导细胞凋亡，同时能够通过改变细胞因子的分泌调控细胞凋亡。3.熊果酸对小鼠肝癌H22移植瘤的抑制及免疫调节作用目的探讨熊果酸对H22荷瘤小鼠抗肿瘤作用及免疫功能的影响。方法体外细胞培养，MTT法检测熊果酸对H22细胞的增殖抑制率，流式细胞术检测细胞凋亡作用；建立H22荷瘤小鼠动物模型，根据小鼠体重，进行区组随机化分组，共分为模型组、环磷酰胺组（CTX，25mg/kg.d）、熊果酸高（40mg/kg.d）、中(20mg/kg.d)和低剂量(10mg/kg.d)，腹腔注射连续给药15天后处死小鼠，计算抑瘤率、胸腺指数和脾指数，MTT法检测T、B淋巴细胞增殖能力，流式细胞术检测CD4+、CD8+T细胞亚群含量及比例，ELISA法检测白介素-2（IL-2）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白介素-4（IL-4）的表达量。结果体外熊果酸对H22细胞生长的增殖抑制呈浓度依赖性，最高抑制率达75.27±3.36%；诱导H22细胞凋亡呈时间依赖性，20μM作用48h后的凋亡率为36.4%±0.2，与对照0.9%±0.1比较，存在极显著性差异（P<0.01）。在体内，与模型组相比，高剂量的熊果酸可显著抑制肿瘤生长（P<0.01），降低荷瘤鼠异常增大的脾指数（P<0.05）；高剂量熊果酸可显著增强T、B淋巴细胞增殖能力（P<0.01），显著提高淋巴细胞亚群CD4+T细胞表达及CD4+/CD8+T细胞亚群比例（P<0.01），对CD8+T细胞表达作用不明显（P>0.05）；高剂量熊果酸促进血清IL-2、TNF-α表达（P<0.05），降低IL-4表达（P<0.01）。表明，熊果酸可抑制H22肿瘤细胞生长，在体内可以提高荷瘤小鼠的免疫能力，其抗肿瘤作用可能与其免疫调节作用相关。4.熊果酸增强小鼠肝癌细胞免疫原性的作用目的探讨熊果酸作为免疫佐剂对小鼠肝癌肿瘤疫苗免疫原性的增强作用。方法UA和H22细胞共培养，制备肝癌细胞疫苗，免疫小鼠后建立肝癌模型，观察肿瘤生长曲线，记录小鼠存活情况，MTT法测定脾淋巴细胞增殖能力，ELISA法测定血清IL-2、IL-4细胞因子含量，流式细胞术测定CD4+、CD8+T细胞亚群百分率，免疫荧光法测定血清中抗肿瘤特异性抗体的产生，ELISA法测定特异性抗体的水平，Western blot检测血清特异性抗体结合能力。结果免疫小鼠后，与模型组相比，荷瘤小鼠肿瘤的生长明显抑制（P<0.05），小鼠的生命延长率明显高于模型组（P<0.01）；与模型组相比，T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖能力显著升高（P<0.01），CD4+/CD8+T细胞含量比例明显升高（P<0.01），血清中细胞因子IL-2、IL-4含量明显升高（P<0.01）。免疫鼠血清可检测到较高水平特异性抗体，抗体亚型IgG2a/IgG1比值明显升高（P<0.01）；Western blot出现四条大小约为95kDa、60kDa、50kDa和34kDa杂交条带。表明，UA作为佐剂能够提高小鼠H22肝癌细胞疫苗的免疫原性，增强小鼠抗肿瘤细胞免疫和体液免疫能力。综上所述，熊果酸能够通过线粒体内源性途径诱导宫颈癌细胞凋亡，ERK1/2信号通路在该过程中发挥重要作用。熊果酸能够提高H22荷瘤小鼠的免疫调节能力，激发小鼠对肿瘤生长的抑制作用。熊果酸能够促进H22肝癌细胞产生免疫原性，激发正常小鼠强烈且长效的抗肝癌免疫保护作用，熊果酸在保护性抗原制备中可能起到了免疫佐剂的作用。该研究为熊果酸作为抗肿瘤药物及肿瘤疫苗免疫佐剂的开发提供了良好的理论基础。