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目的 (1)探讨低温缺氧保存／复氧对ECV-304的NF-κB活性及粘附分子和趋化因子基因表达的影响；(2)探讨在ECs中以及低温缺氧保存条件下，脂质体介导NF-κB诱捕物ODN对ECV-304的转染效率；(3)评价NF-κB诱捕物ODN对ECV-304的NF-κB活性及其下游粘附分子和趋化因子基因活化的影响；(4)建立大鼠移植肾模型并观察含NF-κB诱捕物ODN脂质体复合物的ECs对大鼠肾脏保存的效果；(5)观察在ECs中及低温缺氧保存条件下，脂质体介导诱捕物ODN对大鼠供肾的转染和NF-κB诱捕物ODN对大鼠移植肾早期损伤的保护作用。 方法 一、将培养至融合待用的ECV-304细胞给予低温(4℃)ECs缺氧保存6h，在给予复氧0h，1h，2h，4h，6h，12h。提取各时间点细胞的核蛋白，用EMSA测定NF-κB的DNA结合活性；提取复氧后6h细胞的总RNA，利用RT-PCR技术测定，正常细胞以及复氧后6h细胞的ICAM-1、VCAM-1、P-selectin、IL-8和MCP-1的mRNA表达。 二、将培养至融合待用的ECV-304细胞分别给予含0.5μM、075μ M、1.0μM、1.25μM的FITC标记的诱捕物ODN脂质体复合物的ECs分别保存2h、4h、6h、8h，然后用FCM测定转染百分率和MFI；并用荧光显微镜观察荧光颗粒在细胞浆和细胞核中的分布。 三、用EMSA方法，检测低温缺氧保存6h／复氧4h时，NF-κB诱捕物ODN对细胞NF-κB的DNA结合活性并用RT-PCR技术检测NF-κB诱捕物ODN对细胞的游粘附分子和趋化因子基因表达的影响 四、雄性Wister大鼠和SD大鼠各25只。供体切取范围包括腹主动脉(上至腹腔动脉以下，下至左肾动脉下方约0.8cm)、左肾、左肾动静脉、左输尿管，部分膀胱。受体手术，游离腹主动脉上至肠系膜前动脉，下至左肾动脉下方约1.0cm，肾静脉游离到距肾门约0.5cm，并在左肾下极水平切断输尿管，在肾被膜下游离肾脏并切除。利用钛轮钉吻合技术和/或显微缝合技术(三定点连续锁边缝合)吻合移植肾血管及输尿管膀肤。 将三只供体右肾切除后迅速固定于10%福尔马林作对照;将供肾游离后，用4℃的ECs灌注左肾，低温保存6h后，用10%福尔马林固定，用光镜观察保存效果;将供肾游离后，先用4℃的ECs灌注左肾，再用4℃的含1 pM的NF一KB诱捕物ODN脂质体复合物的ECs灌注，低温保存6h后，用10%福尔马林固定，用观察NF一KB诱捕物ODN脂质体复合物对供肾保存的效果。 五、试验分四组:(1) Control组假手术组，Wister大鼠麻醉后，开腹后，即将伤口缝合，6h后切取左肾;(2) ECs组供肾经ECs(不含脂质体/ODN复合物)低温缺氧保存6h，移植到受体大鼠6h后切取移植肾; (3)deeoy onN组供肾经含1 pM的deeoy onN脂质体复合物的ECs低温缺氧保存6h，移植到受体大鼠6h切取移植肾;(4)sc~.ODN组供肾经含1 pM的scr田nbled ODN脂质体复合物的ECs低温缺氧保存6h，移植到受体大鼠6h切取移植肾。 应用荧光显微镜和多光子共聚焦显微镜观察转染有FITC标记的ODN移植肾，在移植术后巧min和6h时的荧光分布;应用EMSA方法检测经诱捕物ODN转染的肾脏的NF一KB活性;用RT.PCR技术，检测术后6h移植肾中ICAM一l、VCAM一l、MCP一l及RANTES的mRNA表达;用光镜观察诱捕物ODN对移植肾的形态结构的影响;应用免疫组化技术分析移植肾中ED一1细胞数目和分布。结果 一、(l)ESMA证实ECV一304在复氧后lh，其NF一KB的DNA结合活性即开始升高(P<0.OI)，复氧后4h达到高峰并维持在活化状态 (P<0.001)，12h开始下降。复氧后4h，细胞核蛋白与未标记特异性探针反应后，NF一KB与DNA的结合活性被抑制(只0.05);与非特异性探针一sP一l反应后，NF一KB与DNA的结合活性不被抑制。(2)正常ECV一304细胞表达的粘附分子的mRNA极低，而趋化因子的m丑NA则无表达;而ECV一304细胞受到低温缺氧/复氧刺激后，ICAM一1、vCAM一1、P一seleetin、IL一8及MCP一l的mRNA表达水平显著增加(P<0.05)。 二、(1)4℃条件下、含脂质体/ODN复合物浓度分别为0.5林M、0.75林M、1 .0林M、1.25林M以及裸oDN的Ees分别缺氧保存Zh、4h、6h、8h后，ECV一304的胞内MFI随浓度的升高及保存时间的延长而增强。并且在6h即可达到最大强度。同时ECV一304对ODN的摄取率均大于90%以上;而含1.即M裸oDN的Ecs保存6小时后，细胞摄取率仅有1 .31%，有显著性差异(p<0.001)。(2)含裸onN(一0 pM)的Ees低温缺氧保存内皮细胞6h后，胞浆内荧光颗粒少，胞核内偶见荧光颗粒。而含脂质体/ODN复合物的Ecs中，随着浓度的增加和保存时间的延长，胞浆中粗大荧光颗粒增多且胞核内荧光强度增强，含1.opMODN的ECs保存6h和sh后，细胞核呈均匀性强荧光颗粒分布。 三、EMSA发现，Control组RDU约为2.5士0.51;ECs组RDU约为59.81士4.20;与ECs组相比，诱捕物ODN处理组RDU约为6.87士1.85(P<0.OS vs ECs组、scnun.ODN组);而scra刃n.ODN处理组RDU约为51.61士1.73。与Control组相比，ECs组ECV一304的ICAM一l、VCAM一l、IL一8、MCP一1及P一seleetin的mRNA表达显著增加(只0.05)。与ECS组相比，NF一KB诱捕物ODN处理组，ICAM一1、VCAM一l、IL一8、MCP一1及P一seleetin的mRNA表达则被抑制(只0.05);而serambled0DN处理组