背景:结直肠癌(colorectal cancer CRC),在世界范围内发病率及死亡率居恶性肿瘤第三位。据研究数据显示,亚洲地区尤其是经济发达地区,CRC的发生率也迅速增长,接近西方国家。随着我国生活水平的不断提高,饮食习惯的改变,总体发病率也呈上升趋势。因此,CRC严重威胁人们的健康,所以寻找CRC的发病机制成为人们研究的热点。肿瘤生长过程中,需要大量能量供给无限增殖的细胞,细胞的能量主要来自线粒体的有氧氧化和糖酵解。以前认为由于肿瘤生长速度快,长期处于缺氧状态,因此糖酵解在肿瘤的供能方面起主导作用。近年来学者认为两种能量供应途径在肿瘤的形成过程中都起重要作用。因此线粒体在肿瘤中的作用得到广泛关注。线粒体DNA((Mitochondrial DNA,mtDNA)是真核细胞惟一的核外基因,mtDNA的结构特点及其在DNA复制和损伤修复方面的特性,使它的突变率比核染色体高10～100倍。由于线粒体在诱发细胞癌变等肿瘤生物学过程中起着重要作用,mtDNA突变成为目前肿瘤研究的热点之一。目前已在多种肿瘤及肿瘤细胞株中发现mtDNA突变。报道的mtDNA遗传改变包括,发生于编码区及非编码区(即控制区)内的各种点突变、片段缺失、重复或插入突变及微卫星不稳定(microsatellite instability,MSI)等。CRC组织中mtDNA的大片段缺失状况、控制区的突变及微卫星不稳定性和mtDNA的拷贝数有何改变?至今尚不清楚。目前国内外对CRC线粒体的研究较少,围绕它展开研究可能对CRC的发生发展提供新的依据。目的:一、明确mtDNA 4977bp大片段缺失在CRC组织、癌旁组织及正常对照肠黏膜组织中的分布频率,了解CRC组织线粒体基因组控制区(D-loop)突变情况,以及线粒体微卫星不稳定(mitochondrial microsatellite instability,mtMSI)发生频率及其与年龄、组织学病理类型、核微卫星不稳定(nuclearmicrosatellite instability,nMSI)等指标问的关系。二、用精确定量组织细胞mtDNA拷贝数的方法,了解CRC组织、癌旁正常组织中mtDNA拷贝数的改变及其与CRC预后之间的关系。方法:1.本研究采用长距离聚合酶链反应(PCR)方法对50例CRC组织及相应的癌旁正常组织、20例正常人肠黏膜组织样本mtDNA 4977bp缺失突变进行了检测;2.采用长距离PCR和序列测定技术对50例CRC组织及相应癌旁组织、20例正常人肠黏膜组织mtDNA控制区进行测序,检测其突变率;利用primer5.0软件设计三对测序引物,将mtDNA的D-loop区分成三段进行测序。测序结果用软件BIOEDIT与已公布的剑桥序列比较以分析突变的频率和分布,序列变化根据Mitomap网上数据判断为多态性变异和体细胞突变位点;3.用荧光标记PCR及STR扫描的方法对50例CRC患者编码区五个微卫星位点进行了分析,同时检测患者核内两个单碱基微卫星位点;并用卡方检验统计它与年龄、组织病理类型、核MSI之间的关系;4.取我院病理科2005年的60例CRC及对应的正常切缘石蜡标本,每个蜡块以10μm厚度连切5张,显微切割挑出所需组织,提取总DNA。以核基因β-actin作为定量mtDNA拷贝数的内对照,并将其作为二倍体核基因组含量的标记,ND1基因代表mtDNA拷贝数,通过两个单独的实时荧光定量PCR,对组织细胞中mtDNA拷贝数进行计算。计算拷贝数与年龄、性别、病理分型、临床分期、淋巴结转移的相关性,用log-rank试验及Kaplan-Meier方法进行生存分析。结果:一、CRC组织、癌旁正常组织及正常人肠黏膜组织中均检测出mtDNA4977bp片段缺失。CRC组织标本中检测到mtDNA4977 bp的缺失率为10%(5/50例),相应的癌旁组织缺失率为18%(9/50例)有,其中3例CRC组织和癌旁正常组织均有缺失,6例在CRC组织中未发现而却在癌旁正常组织检测到缺失。20例非癌病人正常肠黏膜组织中4977bp片段缺失率为15%(3/20例)。mtDNA4977bp缺失率有随年龄增大而增高的趋势,以年龄60岁,将组织样本分为高年龄组和低年龄组。高年龄组4977bp缺失率显著高于低年龄组(P<0.01)。二、PCR扩增产物测序结果与人mtDNA文库记录的序列比对后,发现50例CRC患者线粒体DNA的D-loop区突变率为32%(16/50)。16例患者发现13个突变位点,突变类型分别是:9个点突变,3个微卫星不稳定,1个缺失突变。其中三个点突变发生在重链的复制起始区,四个点突变发生在高变区Ⅰ。20例正常对照肠黏膜组织中发现2例的16184、16280位点发生突变(10%),癌组织与正常组织相比突变率明显高,差别有统计学意义(P＜0.001)。D303位点的微卫星不稳定为11个,同质性突变3个,异质性突变8个,D514位点突变2个,D16184位点突变2个,均为异质性突变。共发现52个核苷酸多态性变异位点。三、对五个线粒体编码区微卫星位点及两个核微卫星位点检测结果示:共检出mtMSI 15例,发生率为30%(15/50),nMSI检出11例,发生率为22%(11/50),1例右半结肠癌患者全部位点均阳性,5例患者BAT25阳性,9例患者BAT26阳性,6例患者ND1阳性,2例患者ND2阳性,1例患者COIII阳性,2例患者ND5-1阳性,8例患者ND5-2阳性。四、线粒体非编码区及编码区MSI发生率是38%(19/50)与患者性别、年龄及肿瘤的位置及病理类型无相关性(P＞0.05),而与核MSI有关,两者差异有统计学意义(P＜0.05)。五、CRC组织线粒体DNA的平均拷贝数/细胞为108.60±20.11,而相对应的正常组织为153.68±25.72,前者显著低于后者(p＜0.001)。根据癌组织与癌旁组织的比值分成两组进行统计,分界值为0.72,与临床病理指标比较后发现,拷贝数与年龄、性别、病理分型、临床分期无明显相关性,而低拷贝数组30人中12人发现有淋巴结转移,高拷贝数组中只有5人。两者呈负相关(p=0.045)。低拷贝值的患者3年无瘤生存率低于高拷贝值组,但两者无显著差异(P=0.089)。结论:一、结直肠癌变过程中,线粒体缺失不是导致CRC的主要原因。大片段缺失与年龄因素密切相关,反映了mtDNA损伤积累过程中环境和年龄因素的作用。二、线粒体控制区(D-环区)52个核苷酸多态性变异位点,32%(16/50)的体细胞突变率,提示D-环区是一个具有高度多态性的片段,并具有高度突变性。作为线粒体控制区的mtDNA非编码区的遗传不稳定性可能引起mtDNA复制、转录水平的异常,从而导致肿瘤的形成。三、碱基的插入或缺失是CRC发生mtMSI的常见原因。错配修复基因不仅影响核基因还影响线粒体基因。mtMSI在部分CRC的发生发展中起一定作用。四、CRC组织线粒体基因组的拷贝数明显降低,拷贝数与淋巴结转移呈负相关,说明拷贝数的降低也与肿瘤的侵袭性有关。高拷贝数的患者无瘤生存时间长于低拷贝数患者,拷贝数降低提示患者预后不良。