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尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)原产于非洲,是一种重要的世界性经济养殖鱼类。自1978年从苏丹引入我国以来,一直在我国南方广泛养殖。但是随着高密度集约化养殖的发展,各种病害的频发严重制约了罗非鱼养殖业的发展,隶属于扁形动物门单殖亚纲的单殖吸虫可导致罗非鱼幼鱼大量死亡。本研究通过实验感染和转录组测序等手段,对尼罗罗非鱼感染丽鱼三代虫(Gyrodactylus cichlidarum)后,免疫相关通路及基因表达的变化进行了生物信息学分析;根据转录组分析结果,对主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)家族基因在三代虫感染后的表达进行了详细研究;并进一步对MHCⅡα和MHCⅡβ基因的多态性以及等位基因型与罗非鱼对三代虫易感性/抗感染性的关系进行了关联分析与验证,研究主要获得如下结果。转录组测序共完成76个二代样品测序及1个三代样品全长测序,其中三代测序首次获得尼罗罗非鱼全长转录本,使用7个cells获得18.32 Gb的有效数据,得到插入序列485040条,其中全长非嵌合序列256476条;经聚类后获得一致性转录本序列74013个,经非全长序列校正后的高质量转录本序列56926个。利用二代数据对低质量序列进行校正,对去冗余后的32551个转录本进行可变剪接分析,共检测到基因位点16239个,其中新基因位点4259个,新发现转录本26405个。对新发现的转录本进行序列结构分析,共预测出36338个SSR、17614个完整开放阅读框(ORF)序列和4111个长链非编码RNA(lncRNA),完成了23048个新转录本的功能注释。在三代虫感染之后的第2天(感染初期),罗非鱼部分免疫相关基因出现表达变化,在感染后第5天(感染高峰期),表达上调的基因数最多(1443),在感染后第10天(感染消退期),表达上调的基因最少(169)。在罗非鱼的三个免疫组织中,肝脏中差异表达基因最多,其次是尾鳍,脾脏中差异表达基因最少;从不同易感性的罗非鱼各组样品中,分析共得到13642个差异表达基因。表达显著上调的基因主要包括MHC类基因、泛素羧基末端水解酶、补体基因、Toll样受体、趋化因子、T细胞受体、白介素等免疫应激相关基因;这些基因显著富集于抗原加工呈递、Toll样受体信号、细胞粘附分子以及肠组织免疫系统IgA生成等重要免疫通路,其中MHC类基因在多个通路中都有富集。表达显著下调的基因主要包括胶原蛋白、层粘连蛋白、机制重塑关联蛋白、肌球结合蛋白、胰岛素生长因子结合蛋白、G蛋白偶联受体、麦角甾醇生物合成蛋白以及乙酰辅酶A合成酶等,这些基因的差异表达变化与感染后尼罗罗非鱼生长、运动、细胞间信号转导、以及固醇类合成等多项生理及病理变化相关联。本研究首次克隆得到了MHCⅢ类基因中的补体B因子(OnBf)、补体C2(OnC2)以及补体C4(OnC4)基因的全长。OnBf基因cDNA序列全长2505bp,开放阅读框可编码684个氨基酸,OnC2基因开放阅读框全长2385bp,共编码794个氨基酸,OnC4基因cDNA序列全长5360bp,开放阅读框编码1693个氨基酸;OnBf、OnC2和OnC4都在罗非鱼各组织中广泛表达,并且在肝脏、胃及脾脏中表达量普遍较高。感染实验表明,三代虫在感染6天后开始对罗非鱼产生明显影响,个别鱼出现皮肤溃烂,游动缓慢和鳍残缺等症状,相对于皮肤来说,三代虫更容易寄生在罗非鱼的鳍上,并且在面积最大的尾鳍及背鳍上感染丰度最高;在整个感染过程中,三代虫感染率与平均感染强度变化趋势具有一定一致性,都是先上升后下降,在感染第10天时达到峰值。三代虫感染罗非鱼后,MHC家族基因都有不同程度的表达上调,特别是MHCⅡ类基因,其表达趋势与三代虫感染丰度的动态变化趋势有一定一致性,在感染强度较高的8-10 d时间段,其表达上调的幅度更为显著并达到峰值,并且在三代虫与罗非鱼直接接触的皮肤组织以及主要免疫器官头肾组织中的表达上调幅度要远大于肝脏以及脾脏中。这些结果表明MHC基因在尼罗罗非鱼免疫单殖吸虫感染过程中发挥了重要作用。通过连续两次强度递增的三代虫感染实验获得了罗非鱼易感群体46尾,中间群体40尾和抗感染群体50尾。MHCⅡ类基因的多态性分析结果表明MHCⅡα与MHCⅡβ基因在尼罗罗非鱼中都有很高的多态性,抗感染群体MHC的多态性要明显高于易感群体,新发现MHCⅡα等位基因50个,MHCⅡβ等位基因40个,分别命名为Orni-DAA*0101-5001与Orni-DAB*1001-4901。这些等位基因在不同易感性的罗非鱼群体中的分布差异很大,其中Orni-DAA*0701、OrniDAA*1001、Orni-DAA*1901、Orni-DAA*3601、Orni-DAB*0901、Orni-DAB*1401、Orni-DAB*1801、Orni-DAB*2901、Orni-DAB*0701、Orni-DAB*0601和OrniDAB*3501在各群体中分布差异显著(P<0.05),Orni-DAA*0101、OrniDAA*0201、Orni-DAA*1601与Orni-DAA*1801在各群体中分布差异极显著(P<0.01)。独立验证实验证实:等位基因Orni-DAA*0201,Orni-DAA*0701,OrniDAB*0901和Orni-DAB*3501与易感性显著相关(P<0.05),等位基因OrniDAA*3601和Orni-DAB*1401与抗感染显著相关(P<0.05),这些等位基因有望作为分子标记应用于罗非鱼抗病(寄生虫)育种工作中。