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【目的】观察端粒酶特异性抑制剂叠氮胸苷(3’-azido-2’3’-dideoxythymidine,AZT)对人TJ905胶质母细胞瘤细胞系(TJ905细胞)端粒酶活性的抑制作用,以及抑制端粒酶活性后对TJ905细胞增殖和凋亡的影响。检测抑制端粒酶活性能否上调TJ905细胞抑癌基因生长抑制因子1(Ihibitor of growth 1,ING1)的表达,分析TJ905细胞的ING1基因表达变化与其增殖活性和凋亡程度的相互关系。旨在探讨抑制端粒酶活性后对恶性胶质瘤细胞增殖和凋亡影响的下游作用机制;了解ING1基因编码产物p33ING1b在该机制中的作用和作用地位;评价AZT治疗恶性胶质瘤的效果和应用前景。最终目的是进一步加深对恶性胶质瘤发生、发展机制的认识,为以端粒酶为靶点进行恶性胶质瘤化学药物靶向治疗的可行性提供客观的实验依据。【方法】将TJ905细胞按1~5×105/ml接种于75cm2培养瓶中培养至对数生长期,随机分为四组:对照组、AZT 50μM组、AZT 100μM组、AZT 200μM组。常规传代培养,取第一、三、六代进行以下检测:以端粒重复扩增法(telomericrepeat amplification proteocol,TRAP)检测经不同浓度AZT作用后TJ905细胞端粒酶活性的变化;以细胞集落形成实验评价AZT对TJ905细胞增殖活性及生长速度的影响;通过Ki-67和GFAP表达的免疫细胞化学检测,观察AZT抑制TJ905细胞增殖和诱导其衰老凋亡的作用;以流式细胞术(FCM)、单细胞凝胶电泳分析法(single cell gel electrop horesis assay,SCGE)和TUNEL法,检测不同浓度AZT对TJ905细胞凋亡和细胞周期的影响;采用逆转录PCR(reverse transcript PCR,RT-PCR)方法检测用不同浓度AZT作用后,TJ905细胞p33ING1b mRNA的表达变化。【结果】端粒酶活性检测结果显示,各用药组端粒酶活性均明显低于对照组,AZT200μM组端粒酶活性下降最明显。说明AZT能有效的抑制TJ905细胞的端粒酶活性,其抑制作用呈现剂量依赖性。细胞集落形成实验结果证实,三个用药组TJ905细胞的克隆形成率均低于对照组(P<0.01),AZT 200μM组的克隆形成率低于AZT 50μM组及AZT 100μM组(P<0.01),差异均有显著性。免疫细胞化学检测结果显示,各用药组第六代TJ905细胞的Ki-67阳性细胞标记指数均明显低于第一代(P<0.01),而各用药组第六代TJ905细胞的GFAP阳性细胞标记指数均明显高于第一代(P<0.01),差异均有显著性。以上结果说明AZT可通过抑制TJ905细胞的端粒酶活性,有效的抑制其增殖活性和诱导其成熟分化。单细胞凝胶电泳检测结果显示,各用药组TJ905细胞在第一代时彗星拖尾细胞(凋亡细胞)的数量即有增加,凋亡指数(AI%)高于对照组,有显著性差异(P<0.01);在第六代时DNA切割进一步加重,凋亡细胞彗星拖尾的尾矩明显延长。TUNEL检测结果显示,各用药组TJ905细胞在第一代时凋亡指数与对照组相比即增加,并有显著性差异(P<0.01);传代培养至第六代时,各用药组的凋亡指数均较第一代升高,且第六代的AZT 200μM组及AZT 100μM组的凋亡指数均高于AZT 50μM组,差异有显著性(P<0.01),与单细胞凝胶电泳检测结果趋势相同。流式细胞分析显示,各用药组的TJ905细胞在第一代即可出现凋亡峰,但凋亡率比较低;传代培养至第六代时再次出现明显的凋亡峰,凋亡率达29%。以上结果说明AZT可通过抑制TJ905细胞的端粒酶活性,有效的诱导其凋亡。尽管在二~五代未见明显的凋亡峰,但细胞周期的分布发生了改变,与对照组相比较,各用药组TJ905细胞的G0/G1期细胞比例增多,S期细胞比例减少,说明在此期间AZT还可通过阻滞TJ905细胞由G0/G1向S期过渡抑制其增殖。经RT-PCR检测发现,各用药组TJ905细胞P33ING1b mRNA的相对灰度值均高于对照组,并随用药浓度增加和作用时间延长而相应增高,各组之间以及同一浓度不同代数之间的比较均有显著差异(P<0.01)。经直线相关分析证实,第六代中各组P33ING1b mRNA相对灰度值与克隆形成率和Ki-67 LI%呈显著负相关(r=-0.994~-0.990,p<0.01)与原位细胞凋亡标记的和单细胞彗星电泳检测的AI%呈显著正相关(r=-0.996~0.999,p<0.01)。说明AZT通过抑制端粒酶活性能上调P33ING1bmRNA的表达水平从而发挥其抑制细胞增殖和诱导细胞衰老和凋亡作用。【结论】通过本研究证实:1.端粒酶异常再活化是恶性胶质瘤细胞无限增殖和凋亡抑制的根本原因,端粒酶抑制剂AZT能有效的抑制人胶质母细胞瘤细胞系(TJ905细胞)的端粒酶活性,其抑制作用呈剂量依赖性关系。2.抑制TJ 905细胞的端粒酶活性后,能上调该细胞系的P33ING1b(抑癌基因ING1的编码产物)表达,其表达水平与AZT用药浓度成正比。3.抑制TJ 905细胞的端粒酶活性后,可阻滞肿瘤细胞由G0/G1向S期过渡,有效的抑制了该细胞系的增殖活性,并诱导其成熟分化和衰老凋亡。4.各用药组的p33INo1b表达水平随AZT用药浓度增加而依次递增,与肿瘤细胞的克隆形成率及Ki-67标记指数呈负相关,与肿瘤细胞的凋亡标记指数呈正相关。5.以上结果说明,端粒酶再活化可通过直接或间接抑制P33ING1b表达,促进恶性胶质瘤细胞增殖及抑制其衰老凋亡;AZT能有效的抑制端粒酶活性逆转这一异常,通过抑制肿瘤细胞增殖和诱导其衰老凋亡发挥治疗作用。6.以端粒酶为靶点的胶质瘤化学药物靶向性治疗具有临床实际应用价值。