一、目的与意义随着全球工业化进程的不断加快以及环境污染等因素的影响,全球性呼吸道疾病发生率提高较快。变应性鼻炎(AllergicRhinitis, AR)的发病率有逐渐增高趋势。正因为AR如此高的发病率、与过敏性哮喘的密切关系以及对人们生活质量的严重影响,所以对其病因、发病机制、诊断以及治疗各个环节的研究都得到空前重视。根据国际耳鼻咽喉科学联合会(IFOR)31个成员国于1997年发表的综合报告,变应性鼻炎人群患病率为10%-40%。2004年6月在土耳其伊斯坦布尔市召开得第20界欧洲鼻科学会暨第23届世界鼻部感染和变态反应论坛的专题研讨会上,更有专家认为,目前全球变应性鼻炎的发生率在过去几十年间呈上升趋势,约为人口总数的10%-50%。故变应性鼻炎己被视为全球性健康问题。目前业内专家一致认为变应性鼻炎和支气管哮喘是一个被低估了的疾病,主要是指低估了它的严重性(对生活质量的显著影响和人与自然的和谐)、患病率或发病率与上下呼吸道炎症反应的相关性等问题。并强调应重视对变应性鼻炎的研究。根据2001年世界卫生组织发布的关于变应性鼻炎及其对哮喘的影工作组报告所推荐的要点指出：变应性鼻炎首次被定义为慢性呼吸道炎症性疾病。其特点是：高流行率；影响患者生活质量(如睡眠、工作和学习效率等)；增加患者经济负担；与支气管哮喘、鼻窦炎和结膜炎有关；并强调AR应该与其他已知的危险因素一起被视为导致哮喘的因素之一,同时将变应性鼻炎进行了新的分型,即间歇性和持续性；根据变应性鼻炎的类型和严重程度,提出阶梯式治疗方案等。我国学者在2004年依据我国国情对本病的定义进行了修改和补充,主要强调变应性鼻炎的特点是慢性炎症性反应,再次强调了上下呼吸道炎症反应的一致性和相关性,强调变应性鼻炎和支气管哮喘是同一个疾病实体,在诸多方面(如流行病学、组织解剖学生理学、病理学、免疫学、临床学和治疗学)有共同性。世界卫生组织(WHO)、世界过敏组织(WAO)在2005年将每年的7月8日确定为“世界过敏日”。目前变应性鼻炎与哮喘的关系得到越来越多地重视,许多流行病学报告显示,哮喘在AR患者中发病率可高达40%,且哮喘发病率与AR的严重程度呈正相关关系。在AR的治疗过程中应注意评估支气管哮喘,治疗支气管哮喘的过程中应注意评估变应性鼻炎。将变应性鼻炎的临床表现与是否影响患者的生活质量相结合,提出变应性鼻炎新的分类方法和轻、中、重疾病程度的界定。根据病情严重程度和症状是否持续,制定了相应的治疗原则,并强调药物治疗的重要性。变应性鼻炎,也称为过敏性鼻炎,通常指由IgE介导的鼻黏膜I型变态反应,病因和发病机制复杂。其发病机制比较公认的是与众多的Th2型细胞因子如IL-3、IL-4、IL-5,细胞间粘附分子-1 (intereellularadhesionmoleeule-1, ICAM-1)以及部分神经肽的相互作用密切相关。当变应原接触鼻黏膜后,机体在一定浓度的变应原持续刺激下,由抗原呈递细胞(单核/巨噬细胞和树突状细胞等)将变应原传递给CD4+T淋巴细胞,后者释放的抗原肽信号激活T淋巴细胞向Th2分化释放多种细胞因子包括IL-3、IL-4、IL-5,通过这些细胞因子刺激B淋巴细胞,使之转化为浆细胞并合成IgE抗体,IgE抗体与肥大细胞、巨噬细胞表面受体结合通过组织液和血液,到达肥大细胞和嗜碱性粒细胞并与之结合,从而使机体被致敏。此时,来源于上皮细胞、巨噬细胞、肥大细胞、内皮细胞的粘附分子(ICAM-1)、IL-3、IL-4、IL-5等对嗜酸性粒细胞(eosinophil, EOS)有较强趋化作用的细胞因子的合成与分泌增加。所以当机体再次与变应原接触后,变应原经抗原呈递细胞与肥大细胞表面的IgE抗体结合,释放组胺、缓激肽、白三烯等多种炎性介质、细胞因子及神经肽类,从而激发IgE介导的变应性炎反应,使患者出现变态反应症状。首先患者在数分钟内出现急性变应性症状,即变态反应过程的速发相反应(early-phase response, EPR)阶段,在此阶段肥大细胞起核心作用。致敏个体在抗原持续作用下,IgE抗体使肥大细胞活化脱颗粒,释放组胺、蛋白酶(类胰蛋白酶和胃促胰酶)等炎性介质。同时,活化的肥大细胞在数分钟至数小时内,合成并释放新的炎性介质,包括前列腺素(prostaglandins, PGS)、半肌氨酞白三烯(cysteinyl leukotrienes, CysLTs)(白三烯C4、白三烯D4、白三烯E4)、血小板活化因子、缓激肽和细胞因子(IL-4、IL-5、GM-CSF等)等。这些炎性介质一方面引发鼻痒、眼痒、水样涕、连续喷嚏和不同程度的鼻阻塞等症状,另一方面刺激嗜碱性粒细胞,使炎性介质作用于血管内皮细胞,表达血管细胞粘附分子(vascular-cell adhesion molecule, VCAM)和选择素E,导致血液循环中的白细胞和血管内皮细胞粘附,在具备趋化作用的细胞因子的协同作用下,促使炎性细胞浸润鼻黏膜组织。在接触变应原后的6-9小时内达高峰,然后逐渐消退。临床上以鼻阻塞为主要症状的阶段为迟发相反应(late-phase response, LPR)阶段,在此阶段,鼻黏膜中浸润的炎细胞活化并释放炎性介质,可再次激发速发相反应,使急性变应性症状反复出现。迟发相反应阶段的症状持久,除鼻阻塞症状外,也有喷嚏发作及流清涕。中医学有极其悠久的历史,对变态反应学有很朴素的认识。古籍《淮南子·修务训》一章中有“神农尝百草,一日而遇七十毒”的记载。从现代变态反应学观点来看,神农一日所遇的七十毒中,必然可能有食物的变态反应存在。相传神农于公元前2000年已告诫人们“孕妇应忌食马肉,食后可能引起皮肤的恶疮”。这一现象,从现代医学观点来看无疑属于食物变态反应一类。故至今西方的一些变态反应学者,均认为中国人是食物过敏的最早发现者。中医很早就有变应性鼻炎的记载,如在西周《礼记·月令》中有记载：“季秋行夏令,则其国大水,冬藏殃败,民多欺嚏。”认识到本病的发生和气候变化有关系。《素问·宣明五气论篇》有：“肾为欠,为嚏”,认为肾有病会打哈欠和喷嚏。到隋代,明确地提出了鼻鼽的病因病机,《诸病源候论》说：“肺气通于鼻,其藏有冷,冷随气入乘于鼻,故使津液不能自收。”认为肺脏有冷,冷气侵鼻而发病。汉代的《伤寒论》及《金匾要略》有数条以麻黄为主药的方剂如麻杏石甘汤、小青龙汤等治疗咳喘,到目前为止西医学用提取的麻黄素或人工合成的伪麻黄碱等治疗咳喘,均源出于麻黄。小青龙汤出自汉·张仲景的《伤寒杂病论》,是临床治疗咳喘常用的经验方,原方组成为麻黄、桂枝、细辛、干姜、白芍、半夏、五味子、甘草,具有发散风寒、调和营卫的作用。以咳喘为主症的过敏性哮喘和变应性鼻炎在病因病理及治疗等方面很相似且互为因果,以麻黄为主药的很多麻黄方剂如小青龙汤、麻黄附子细辛汤等常用来治疗哮喘,现在用来治疗变应性鼻炎也取得较好效果。小青龙汤作为一首《伤寒论》名方,为广大临床医生所熟用。但临床用量却存在很大的差异,在《方剂学》(5版)中现代药物剂量注为：麻黄9g、桂枝9g、细辛6g、干姜6g、五味子6g、半夏9g、甘草6g、白芍9g,共60g。近年来,许多医家应用大剂量小青龙汤取得良好效果,如任广毅用大剂量小青龙汤(炙麻黄20克,白芍20克,桂枝20克,干姜20克,细辛20克,法半夏20克,五味子20克,甘草20克)治疗肺心病,小青龙汤用量是原剂量的2倍以上,细辛的剂量是临床常用量的6倍,但未发现毒副反应,且收到良好的效果,他认为《伤寒论》中的小青龙汤原剂量小,临床疗效甚微。陈宝田教授精研《伤寒论》,在长期的临床实践中应用大剂量小青龙汤,总量为72克,细辛用量为9克,不但未见不良作用,而且疗效显著。因此,通过本课题通过设计变应性鼻炎大鼠模型,进一步验证小青龙汤大剂量的疗效,为小青龙汤的剂量应用提供依据。本研究分为两部分：一、梳理小青龙汤的古今文献研究、药理研究进展；二、建立变应性鼻炎大鼠模型,初步探索小青龙汤治疗变应性鼻炎的机制。二、方法与内容1、小青龙汤的文献研究系统阐述了小青龙汤方证探析、药理研究进展及临床研究现状,及小青龙汤的用量研究。并得出小青龙汤治疗变应性鼻炎的理论依据：其外散风寒,温阳化饮的治法与变应性鼻炎的部分病机一致。2、变应性鼻炎的文献研究回顾传统医学对变应性鼻炎的病名、病因病机的认识,治疗现状及实验研究概况。3、变应性鼻炎动物模型的建立及小青龙汤的干预作用3.1动物分组及模型建立雄性SPF级豚鼠50只随机分为5组,每组10只,分别为正常组(A组)；模型组(B组)、氯雷他定组(C组)、小青龙汤高、低剂量组(D、E组)。小青龙汤高剂量组(导师经验剂量)：麻黄9g桂枝9g、细辛9g、干姜9g、五味子9g、半夏9g、甘草9g、白芍9g。小青龙汤低剂量组(6版方剂学推荐剂量)：麻黄9g、桂枝9g、细辛6g、干姜6g、五味子6g、半夏9g、甘草6g、白芍9g。适应环境1周后进行致敏造模。致敏组均首先选用OVA:Al(OH)3以1：5的比例用生理盐水配制,使OVA浓度为1ng·ml-1,双侧鼻孔每侧、每次20μl,每天2次,连续10d,正常对照组先以5 ng·ml-1Al(OH)3溶液代替滴鼻；间隔5d后模型组以5%OVA溶液滴鼻激发,每侧鼻孔20μl,隔3d激发1次,连续激发9次,正常对照组则以生理盐水代替激发。参照文献[3]自给致敏药开始,依据鼻痒、喷嚏、流涕轻重程度、次数多少、出现的时间长短为评分标准并评分记录,每次观察20min,每次症状评分迭加达5分或以上者为模型成功。3.2动物药物干预各组均于造模成功后第1d开始灌胃给药,A、B组：生理盐水灌胃2ml/次；C组：氯雷他定混悬液0.1mg·kg-1·d-1灌胃(选用临床常用剂量根据实验动物学剂量换算方法得到大鼠灌胃剂量)；D、E组分别为小青龙汤高剂量水煎液6.49g·kg-1·d-1、低剂量水煎液5.36g·kg-1·d-1灌胃,连续给药14d,并分别于给药第7天及第14天给药1h后再次激发一次。3.3症状学观察分别记录各组在第11次激发后、给药第7天激发后及给药第14天激发后30min内豚鼠擦鼻次数、打喷嚏次数及流涕程度进行评分并迭加比较。3.4组织病理学观察于用药第14天给药1.5h后,各组随机选取3只腹腔注射10%水合氯醛麻醉并处死。迅速剥离鼻部皮肤,将连同鼻腔的上颌骨取下,自中切齿间分离双侧鼻腔,小心取出双侧鼻甲及鼻中隔黏膜,用4%多聚甲醛固定,并依次经过组织脱水、透明、浸蜡、包埋制作常规石蜡组织块,后经旋转式切片机切片,片厚4μm,经HE染色后封片,于光学显微镜下观察并比较各组豚鼠鼻黏膜炎性浸润情况。3.5 ELISA法检测治疗过程中血清中OVA-sIgE的浓度变化各组豚鼠分别于给药前及末次给药后足静脉采血,采血量为0.5ml,血样本在室温下凝固2h,3000r·min-1离心,分离血清-20℃保存待用。根据试剂盒说明书进行操作。4数据处理运用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。各组检测结果均以x±s表示,各组豚鼠症状学评分及血清中OVA-sIgE浓度比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)进行统计分析,方差齐采用LSD法进行两两组间比较；各组治疗前后血清中OVA-sIgE浓度的比较采用配对t检验,P<0.05表示差异具有统计学意义,P<0.01表示差异有显著统计学意义。三、结果1.造模过程中豚鼠外观表现致敏组均于第1次激发后,出现活动减少、倦卧嗜睡、被毛蓬松等症状,并于第1次激发后20min出现不同程度的擦鼻、喷嚏,随着激发次数的增多,上述症状加重并逐渐出现流涕,于第11次激发后致敏组豚鼠评分迭加均达5分以上,正常对照组豚鼠均反应灵活,活动频繁,毛色润洁,未见擦鼻、喷嚏、流涕等症状。2.小青龙汤对变应性鼻炎豚鼠不同用药时间点症状学的影响用药7天后,氯雷他定组与小青龙汤高剂量组的擦鼻次数和打喷嚏次数明显减少,流涕程度减轻,与模型组比较有显著性差异(P<0.05)；用药14天后,各用药组的擦鼻次数和打喷嚏次数均较模型组显著减少(P<0.05),流涕程度较模型组显著减轻(P<0.05),减少幅度为小青龙汤高剂量组>氯雷他定组>小青龙汤低剂量组,小青龙汤低、高剂量组的症状改善程度呈逐渐递增趋势。3.小青龙汤对变应性鼻炎豚鼠鼻黏膜病理变化的影响空白组豚鼠鼻黏膜结构完整、清晰,披覆假复层纤毛上皮,黏膜固有层组织疏松,散在淋巴细胞及少量嗜酸性粒细胞浸润；模型组豚鼠鼻黏膜上皮部分脱落,排列不整,杯状细胞增生,固有层组织明显水肿,大量淋巴细胞及嗜酸性粒细胞浸润；氯雷他定组豚鼠鼻黏膜结构清晰,固有层间质轻度水肿,少量嗜酸性粒细胞分布；小青龙汤高剂量组豚鼠鼻黏膜结构清晰,固有层水肿无充血,可见少量淋巴细胞及嗜酸性粒细胞；小青龙汤低剂量组豚鼠鼻黏膜上皮少量脱落,固有层间质中度充血水肿,小血管扩张,灶性分布的淋巴细胞及嗜酸性粒细胞浸润。与模型组比较,各治疗组豚鼠鼻黏膜结构较完整,固有层水肿程度减轻,嗜酸性粒细胞均明显减少。4.小青龙汤对变应性鼻炎豚鼠血清中OVA-sIgE浓度的影响各用药组在治疗后血清中OVA-sIgE浓度均降低,配对样本t检验结果显示,各用药组在治疗前后OVA-sIgE的浓度差异均有显著性(P<0.05)。末次给药后各组豚鼠血清中OVA-sIgE的浓度,方差分析结果显示,各组间有显著性差异(P<0.05),与模型组相比较,氯雷他定组、小青龙汤高剂量组及小青龙汤低剂量组豚鼠血清中OVA-sIgE的浓度均显著下降(P<0.05),小青龙汤高、低剂量组血清中OVA-sIgE浓度下降程度为高剂量组>低剂量组。四、结论1.小青龙汤能显著改善变应性鼻炎大鼠擦鼻、喷嚏、流涕等症状；2小青龙汤各剂量组可以减轻鼻黏膜细胞充血水肿,减少嗜酸性细胞、淋巴细胞浸润,并存在一定的量效关系；3.小青龙汤能显著降低血清中OVA-sIgE浓度,并且存在一定的量效关系。