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下丘脑神经肽促性腺激素抑制激素(gonadotropin-inhibitory hormone,GnIH)及亲吻肽(kisspeptin,Kiss)在哺乳类生殖调控中起着直接而相反的作用。为了研究二者对鱼类生殖轴的调控作用,本文以半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)为研究对象,首先运用RT-PCR及RACE方法克隆获得了gnih及其受体gnihr、亲吻肽受体kiss2r的全长cDNA序列,并鉴定出了部分kiss2序列。进一步分析发现gnih编码两种多肽Gn IH-1及GnIH-2,而kiss2编码一种核心十肽Kiss2-10。随后,采用实时荧光定量PCR技术检测了gnih/gnihr及kiss2/kiss2r的组织分布以及gnih在卵巢不同发育时期的时空表达特性。最后,通过离体孵育实验,结合实时荧光定量PCR及ELISA方法分别研究了GnIH和Kiss多肽对半滑舌鳎下丘脑生殖相关基因表达与垂体激素合成及分泌的影响。主要研究结果如下:1.Gn IH/GnIHR系统鉴定1.1半滑舌鳎gnih/gnihr基因克隆和组织表达分析采用RT-PCR及RACE方法首次从半滑舌鳎脑中克隆得到了gnih/gnihr的全长cDNA序列。半滑舌鳎gnih cDNA全长为918 bp,其中5’非编码区(untranslated region,UTR)为24 bp,3’UTR为309 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)为585bp,编码194个氨基酸的前体多肽。Gn IH前体蛋白分子质量为21.73 kDa,等电点为6.52。Gn IH前体多肽编码GnIH-1和GnIH-2两种多肽。gnihr cDNA全长为2201 bp,其中5’UTR为60 bp,3’UTR为776 bp,ORF为1365 bp,编码454个氨基酸。Gn IHR属于G蛋白偶联受体,包括七个跨膜区,七个磷酸化位点及五个糖基化位点。组织分布结果显示gnih主要在脑中表达,在卵巢、心脏、胃中的表达量相对稍低;在垂体及其他外周组织中表达量极低;gnihr主要分布于脑、垂体中,其次为卵巢、心脏,但在其他外周组织中表达量较低。1.2半滑舌鳎gnih在卵巢不同发育时期的时空表达特性在卵巢成熟过程中,脑gnih mRNA表达量在卵黄生成期(III期)略微增加,在成熟期(V期)显著性下降,然而在排卵后期(VI期)又显著性增加并达到峰值;垂体gnih mRNA表达量除在成熟期(V期)显著性增加并达到峰值外,在卵巢成熟的其他时期保持稳定;卵巢gnih mRNA表达量在卵黄生成期(III期)急剧下降,并在整个卵巢成熟过程中保持较低的表达水平。1.3 Gn IH对半滑舌鳎下丘脑生殖相关基因表达调控的影响本研究首次通过下丘脑离体孵育的方法分析了GnIH多肽对半滑舌鳎下丘脑生殖相关基因表达调控的影响。研究结果显示,GnIH-1促进了gnrh2和gnih的表达,但是对gnrh3和kiss2的表达无显著影响;然而GnIH-2抑制了gnrh3的表达,对gnrh2、kiss2和gnih的表达无显著影响。1.4 Gn IH对半滑舌鳎垂体激素合成及分泌的影响本研究首次通过垂体离体孵育的方法分析了Gn IH多肽对半滑舌鳎垂体促性腺激素(gonadotropin,GTH)及生长激素(growth hormone,GH)合成及分泌的影响。结果表明,Gn IH-1促进了gh mRNA的表达,对lhβ、fshβ、gthαmRNA的表达无显著影响;Gn IH-2则对这些基因的表达均无显著影响。此外,Gn IH-1与GnIH-2均抑制了LH分泌,但对GH及FSH分泌无显著影响。2 Kiss/KissR系统2.1半滑舌鳎kiss2/kiss2r基因克隆和组织表达分析本研究克隆得到了kiss2的部分cDNA序列,该序列长度为274 bp,编码90个氨基酸的前体蛋白。该前体多肽包括功能核心十肽Kiss2-10(FNFNPFGLRF)。半滑舌鳎kiss2r全长cDNA序列为1966 bp,其中5’UTR为342 bp,3’UTR为481bp,ORF为1143 bp,编码380个氨基酸。Kiss2R也属于G蛋白偶联受体,包括七个跨膜区,八个磷酸化位点及三个糖基化位点。组织分布结果表明kiss2 mRNA主要在卵巢中表达,在脑与垂体中表达量相对较高,但其他外周组织中表达量较低。然而kiss2r则主要在脑中表达,在垂体及其他外周组织中表达水平较低。2.2 Kiss2对半滑舌鳎下丘脑生殖相关基因表达调控的影响本研究首次通过下丘脑离体孵育的方法研究了Kiss2对半滑舌鳎下丘脑生殖相关基因表达调控的影响。结果表明,Kiss2对gnrh2和gnrh3表达无显著影响;Kiss2促进了gnih的表达,却抑制了gnihr的表达;此外,Kiss2促进了自身配体kiss2的表达,却抑制了自身受体kiss2r的表达。2.3 Kiss2对半滑舌鳎垂体激素合成及分泌的影响本研究首次通过垂体离体孵育的方法研究了Kiss2对半滑舌鳎垂体GTH和GH合成及分泌的影响。研究结果表明,Kiss2对gthα、lhβ、fshβ和gh表达无显著影响;此外,Kiss2也对垂体GH分泌无显著影响,却显著性抑制了LH和FSH分泌。