各种疾病造成的角膜基质不可逆性混浊是视力丧失的主要原因。而近年来由于外伤或手术原因促使角膜盲患者逐年增多。而同种异体角膜移植是治疗角膜盲患者最为直接、最为有效的方法，目前已使上百万致盲人群恢复了有用视力。但是供体来源不足、免疫排斥反应、角膜移植并发症、角膜供体老龄化及激光手术的广泛开展等限制了此项技术的开展。因此，积极寻找新的角膜材料是眼科界有待解决的问题。目前，人工角膜虽然具有良好的透光性和能维持角膜的完整性，但由于其手术要求极高并且并发症较多在临床应用上受到了较大程度的限制。天然及合成材料如羊膜、壳聚糖等已作为材料应用于组织工程角膜支架的构建，虽然这些材料具有良好的生物相容性，移植后可维持眼球的完整，并能在一定程度上恢复角膜的透明度，但由于其缺少天然角膜的结构，依然存在很多不足，例如透明度不高，不能耐受缝线切割，机械性能较差等。近年来，新型组织工程角膜的构建与应用已成为国内外学者研究的热点和难点。在组织工程技术和再生医学研究中，去细胞生物支架材料如心脏瓣膜、血管和肝脏等，已经进入临床前期动物实验或临床治疗阶段。目前，合适的支架材料则是构建组织工程角膜的关键，而角膜又具有其他一切组织不具有的鲜明特点：透明，这个特点主要与高度规则的基质层胶原排列有关。因此彻底去除角膜基质细胞较好的保留细胞外基质成分也就成了脱细胞方法中的关键要素。　　 本研究应用100％新鲜血清联合额外的4℃低温电泳处理新鲜猪角膜基质，并研究其脱细胞机制和整个过程，选择了最适合人角膜移植的兔板层角膜移植模型，寻找到了一种脱细胞效果彻底且能完整保留组织结构的方法，并将此法制备的组织工程角膜进行了各项组织学(光镜/电镜/免疫荧光等)、生物化学、生物力学等检测以筛选出最佳的制备方法，继之通过细胞毒性、组织相容性及生物安全性的检测确定其作为组织工程角膜载体材料的可行性，初步行板层角膜移植手术修补兔角膜基质缺损，发现效果显著，这为板层组织工程角膜临床应用提供可靠的实验依据和理论基础。　　 第一部分、α-gal在不同种动物眼表组织的表达和分布　　 目的：探讨α-Gal基因在不同物种、不同种属和不同发育阶段的动物眼表组织的表达和分布。　　 方法：使用相机和裂隙观察动物眼部大体情况，使用苏木素与伊红和GSIB4对各种动物眼睛切片进行染色。　　 结果：照片和裂隙灯观察显示，苏木精和伊红染色显示备用角膜透明和组织结构完整。GSIB4凝集素在无脊椎动物眼表组织(河虾、龙虾、章鱼)和脊椎动物眼表组织(皖鱼、青蛙、牛蛙、蜥蜴、龟、鳖、小鼠、大鼠、豚鼠、兔子、猪、山羊、绵羊、黄牛、肉牛)等物种均有不同程度的表达。而在鸟类(鹌鹑、鸡、鸭、鹅)，鱼类(金鱼和鲷鱼)和哺乳动物(恒河猴和人类)等未见有染色。　　 结论这项研究为角/结/巩膜异种动物移植模型选择(高危和免疫赦免模型)及角膜替代材料选择提供了参考依据，缺少α-Gal的角膜基质，包括鸟类、鱼类表示及部分哺乳动物，可作为移植材料用于眼表异种移植，而高表达α-Gal的角膜基质则可能通过抗原排斥反应去除基质细胞，为筛选出合适的角膜支架奠定基础。　　 第二部分、血清法制备板层组织工程角膜的实验研究　　 目的：筛选并制备脱细胞猪角膜基质的最佳方法并检测其生物学性能，评价异种脱细胞角膜基质的细胞毒性及组织相容性，探讨采用脱细胞猪角膜基质修补角膜基质缺损的可行性和安全性，为板层组织工程角膜的构建提供理想的载体材料。　　 方法：　　 1.ACSDs材料的制备和检测　　 新鲜猪眼球取自当地屠宰场(200-250kg,2月，雌雄不限)，先用角膜测厚仪测厚，选取800-1000 m透明猪角膜，含抗菌素的PBS浸泡5-10min，PBS冲洗3次×5min；角膜上皮刀轻轻的擦除上皮细胞层；手术显微镜下分离厚度约为0.3mm的前层角膜，剪下前层角膜，放于角膜枕上(前弹力层面朝下)，钻取6.5mm直径的板层角膜基质片(10-0尼龙线标记上皮面)。然后将其放于100％人新鲜血清密闭无菌的5mlEP管内24小时；然将其放置于特殊的电泳液-TA液中，4℃恒温冰箱内进行低温电泳1hs，电泳的电压为150V，PBS冲洗3次×5min;梯度脱水，保存备用；然后对ACSDs材料进行评估和检测，包括组织化学染色(HE，DAPI，GSIB4，Vimentin和α-SMA染色)，DNA检测，超微结构分析和力学和物理学特性检测等。　　 2.ACSDs生物相容性和安全性评价　　 60只纯种新西兰白兔(2-2.5kg，2月，雌雄不限)备用。将ACSDs体外直接接种(HCE、3T3、人角膜基质细胞)观察其细胞相容性；将此其材料做成浸提液分别培养HCE，3T3，人角膜基质细胞检测其生物毒性。此外，我们还将ACSDs用于新西兰大白兔眼睑的皮下植入、颈背部皮下植入、结膜下植入、角膜基质囊袋内植入、眼前房内植入等实验，并与新鲜猪基质对比观察其组织相容性差别。　　 3.ACSDs为植片修复兔角膜缺损　　 18只新西兰白兔随机分为二组，分别接受两组不同材料的板层移植治疗(ACSDs材料和DFPCs材料)，术后观察角膜基质细胞再生、神经再生、眼表各项临床指标的恢复情况，并长期观察角膜透明度改变、新生血管形成、组织化学及超微结构改变。　　 结果：　　 1.ACSDs大体形态及组织学观察　　 经过血清和电泳处理的ACSDs材料几乎透明，表面光滑，韧性强，可缝合。HE、DAPI、GSIB4、Vimentin、α-SMA染色及DNA Gel结果均提示此方法能去细胞彻底，胶原板层保存完好，能完全去除α-Gal抗原，透射电镜提示ACSDs材料纤维排列规则，纤维束大小一致。体外降解实验中，1mm×1mm大小的ACSDs材料在2％胶原酶中18h完全降解，与DFPCs所需时间相当。ACSDs材料与DFPCs材料具有相似的生物学性能包括透光度，密度、孔隙率、膨胀率、含水量、拉伸强度等物理学特性，且在统计学上均无显著性差异(P＞0.05)。　　 2.ACSDs组织相容性和安全性检测　　 体外接种人角膜基质细胞、HCE、3T3细胞后，HE染色示7天时ACSDs材料表面有单层细胞附着。眼睑下、背部皮下、结膜下、眼前房内、角膜囊袋内植入术后1个月取材，提示ACSDs具有良好的组织相容性，在体内未引起免疫排斥，未见炎症细胞长入ACSDs内。细胞毒性实验显示，ACSDs材料具有良好的生物相容性，浸提液组细胞的增殖情况与常规培养液组相当，说明此材料没有明显的细胞毒性。TEM下观察显示，ACSDs前弹力层表面平滑，无破损及断裂情况，无细胞及细胞碎片残余；胶原排列较正常角膜疏松，但基本保留了胶原的规则板层结构。　　 3.ACSDs移植后角膜透明，角膜细胞可长入　　 结论：　　 1.血清联合电泳法脱细胞彻底，ACSDs具有良好的力学及光学性能　　 采用血清浸泡联合电泳法进行缓和的去细胞处理，能够彻底的去除角膜基质细胞，对细胞外基质损伤小，保留了基底膜、前弹力层部分，各项物理特性和光学性能表现良好，为ACSDs材料能在临床和基础应用提供扎实的理论基础。　　 2.ACSDs移植于异体内组织相容性好，无明显细胞毒性　　 采用血清浸泡联合电泳法得到的ACSDs材料无有害成分残留，无抗原性，组织相容性良好，眼睑下、皮下、结膜下、前房内、角膜囊袋内植入后ACSDs无明显排斥反应，炎症反应轻微，同时体外降解速度较为缓慢，足以支持自体角膜组织再生与重建。　　 3.ACSDs可以用于板层角膜支架材料　　 ACSDs异种板层角膜移植后，能诱导自体上皮细胞复层化，兔基质细胞能够沿胶原板层生长，无明显的排斥反应和炎症反应。角膜始终保持透明，能恢复部分角膜形态，角膜基质细胞和上皮细胞能够长期长入，各项临床指标和组织学检测发现ACSDs植入后泪液分泌正常和泪膜恢复情况良好，视功能维持完好，是一种很好的植入材料。　　 综上所述，ACSDs材料具有良好的生物相容性，韧性强，透明度高；ACSDs板层移植可以治疗兔角膜基质缺损，体内、外均支持细胞的三维生长，植片移植保持透明，各项临床指标均接近于正常的兔角膜。因此，ACSDs是一种很有希望的组织工程角膜支架材料。　　 第三部分、板层猪角膜基质脱细胞机制的研究　　 目的：探讨新鲜血清去除猪角膜前板层基质细胞的机制。　　 方法：将24个新鲜猪角膜基质片分为新鲜血清处理组(n=12)和磷酸盐溶液组(n=12)，GSIB4染色(α-Gal的特异性染色)、DAPI染色及TUNEL染色观察不同时间点(8 h，16 h，24 h)角膜基质的细胞状态及脱细胞情况；另20个新鲜猪角膜基质片先用板层刀将角膜分为前、中、后三部分(各1/3)，然后分别用胶原酶进行消化，将收获的细胞分为新鲜血清处理组(n=10)和DMEM/F12处理组(n=10)，活体显微镜下观察细胞观察不同时间点(6 h，12 h)角膜基质细胞生长情况。GSIB4染色、DAPI染色、TUNEL染色及结晶紫染色观察不同时间点(6 h，12 h)角膜基质细胞的染色情况。　　 结论：新鲜血清中抗α-Gal抗体可能与猪角膜前板层基质细胞中的α-Gal发生超急性排斥反应而发生细胞凋亡而产生脱细胞效果。