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研究背景:中肝癌是全球最常见的恶性肿瘤之一,其中肝细胞癌(Hepatocellular cacinoma,HCC)占75%-85%。我国每年新发病例和死亡病例约占全球的50%左右,是肝癌的高发地区。HBV感染是我国肝癌最主要的危险因素,但HBV慢性感染者仅少部分最终罹患肝癌,说明宿主的遗传易感性在肝癌发病机制中占据重要地位。目前单核苷酸多态性(SNPs)被认为是遗传易感性最主要的形式之一。CT基因在睾丸组织及肿瘤组织限制性的高表达,且常常促进肿瘤细胞的恶性表型,参与肿瘤发生发展。PLK4是一个最新鉴定的癌-睾丸(CT)基因。该基因是调控中心粒复制的最关键的基因之一,且已有研究报道其参与了乳腺癌、前列腺癌、胃癌等多种人类肿瘤的发生。我们关注到PLK4基因及其启动子区域存在众多SNPs,同时TCGA和KM-plotter数据库资料显示PLK4在肝癌中被异常激活,且与预后不良相关。本研究目的:明确PLK4 SNPs与HBV相关肝癌遗传易感性的关联,分析PLK4在肝癌发生发展中的作用,并在此基础上初步讨论靶向PLK4治疗肝癌的可行性。研究方法:我们采用病例对照研究设计,纳入病例组(HBV相关肝癌)1,300例,对照组(HBV慢性感染患者)1,344例,并按照年龄、性别及居住地进行匹配。基于1000 Genomes Project数据库选取CT基因PLK4及其启动子区域(TSS上游5kb)的所有SNPs,并根据如下质量控制程序进行筛选:(1)最小等位基因频率(MAF)<0.05;(2)哈迪-温伯格平衡(HWE)<0.05)的SNPs;(3)满足上述标准的位点之间根据高连锁不平衡(r2)>0.8构建单倍型。并利用3DSNP网站(http://cbportal.org/3dsnp/)进行功能预测,最终选取其中的3个功能性标签SNPs进行分析。应用Logistic回归模型在相加模型下计算遗传变异的关联P值、比值比(odds ratio,OR)及其95%可信区间。采用多因素Cox 比例风险模型计算PLK4不同表达肝癌患者的死亡风险,以风险比(HR)表示。研究进一步构建PLK4敲降及过表达的肝癌细胞系,通过MTT、平板克隆、划痕及Transwell等体外实验评估PLK4对肝癌细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力影响。药物敏感试验模型用于评估不同PLK4表达状态的肝癌细胞对PLK4小分子抑制剂CFI-400945的敏感性。根据基线表达情况,将细胞株分为PLK4冬高表达组和PLK4-低表达组。以正常肝上皮细胞作为参照,两株PLK4高表达细胞株以及两株PLK4低表达细胞株对比进行药物敏感性实验。研究结果:我们最终筛选出了3个功能性标签SNPs(rs3811741(G>A),rs138343126(T>G)和rs77248006(G>A))进行HBV相关肝癌的关联分析及其功能研究。Logistic回归分析显示PLK4 SNP rs3811741(G>A)与HBV相关肝癌发病关联最强(OR=1.26;P=9.81×10-5)。SNP rs3811741位于PLK4基因内含子区域,ENCODE数据显示该位点位于组蛋白H3K4Me修饰区域,H3K4Mel是活性增强子的生物标志物,表明该位点所在区域具有增强子活性并可以通过转录调控影响PLK4的表达。利用TCGA表达谱数据库进行eQTL分析,结果显示rs3811741基因型A/A的患者PLK4 mRNA水平显著高于G/G基因型,杂合子A/G则介于两者之间。这些结果提示PLK4 SNP rs3811741通过cis-eQTL作用调控PLK4的转录。GTEx正常组织转录组数据库及TCGA肿瘤组织转录组数据库的资料分析显示PLK仅在睾丸组织中高表达,其他正常组织低表达或不表达,而在肝癌组织中PLK4被异常激活,提示PLK4为新发现的CT基因。Cox分析KM-plotter数据库中肝癌患者的PLK4表达与预后,发现PLK4高表达组患者的总生存时间显著短于低表达组,这种差异在亚裔人群更为明显,表明PLK4表达水平与预后负相关,是预后不佳的因素。这些临床数据表明PLK4与肝癌的发生发展相关。为了进一步证实PLK4在肝癌中的癌基因功能,我们进行了体外细胞功能实验。通过诱导PLK4沉默或过表达,肝癌细胞在增殖、克隆形成、迁移和侵袭等方面能力发生了显著变化,沉默后被削弱,过表达后加强,表明在细胞层面PLK4基因在肝癌中发挥促癌基因作用。CT基因PLK4独特的表达模式赋予了其特殊的治疗潜能。我们针对PLK4位点进行的药物敏感性实验显示:PLK4抑制剂CFI-400945极低浓度即可抑制肝癌细胞,且呈剂量依赖关系。PLK4基线表达较高的细胞系显示出更高的敏感性。在siRNA抑制PLK4表达后,CFI400945的抑制作用几乎消失,表明CFI-400945可能通过靶向PLK4发挥抑制肝癌的作用。结论PLK内含子位置上的SNP rs3811741(G>A)是HBV相关HCC发病的遗传易感位点;SNP rs3811741位于组蛋白H3K4Mel修饰的增强子区域,可通过cis-eQTL调控PLK4表达,其等位基因A促进PLK4表达。表达谱数据库分析显示PLK是一种CT基因,在肝癌组织中被异常激活,PLK4高表达提示预后不良。体外细胞系功能实验证实了PLK4在肝癌中的促癌作用;药敏实验表明CFI-400945通过靶向PLK4发挥抑制肝癌的作用,提示PLK4高表达是CFI-400945抑制剂较好的适应症。