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目的肝纤维化是以细胞外基质的过多沉积为特征,细胞外基质的主要来源是激活的肝星状细胞。研究表明上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)在其中也起着重要的作用。EMT是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程,其标志为上皮标志蛋白表达下降和间皮标志蛋白的表达升高。小RNA (microRNA,miR)是一类长度约22-28个核苷酸的非编码小分子RNA,其在转录后水平和翻译水平的基因调控过程中发挥重要作用,参与了许多生理病理过程的调节。我们的前期工作表明miR-21在肝星状细胞激活过程中起着重要的作用。本研究的目的是探讨miR-21在人肝细胞株(QSG-7701)EMT中的作用和机理。方法1.TGF-β1对人肝细胞EMT的作用。用10ng/mlTGF-β1刺激人肝细胞株QSG-7701细胞1、3、5、7天后,显微镜下观察细胞形态的变化,western blot检测上皮标志蛋白(E-钙粘蛋白)和间皮标志蛋白(N-钙粘蛋白、波形蛋白)的表达。2.TGF-β1刺激miR-21的表达。用10ng/mlTGF-β1刺激人肝细胞株QSG-7701细胞1、3、5、7天后,real-time RT-PCR检测miR-21的表达。3.MiR-21介导了TGF-β1对人肝细胞EMT作用。转染100nM miR-21抑制剂(miR-21inhibitor)沉默miR-21后,TGF-β1刺激人肝细胞株QSG-77015天,转染24小时后real-time RT-PCR检测miR-21的表达。TGF-β1刺激5天后显微镜观察细胞形态的变化。western blot检测上皮标志蛋白(E-钙粘蛋白)和间皮标志蛋白(N-钙粘蛋白、波形蛋白)。4.MiR-21对人肝细胞EMT的作用。用100nMmiR-21模拟物(miR-21mimics)转染人肝细胞株,24小时后用real-time RT-PCR检测miR-21的表达。3天后用显微镜观察细胞形态的变化,用western blot检测上皮标志蛋白(E-钙粘蛋白)和间皮标志蛋白(N-钙粘蛋白、波形蛋白)。5. PTEN/Akt通路介导了人肝细胞EMT(1)TGF-β1刺激细胞后,western blot检测PTEN。(2)转染miR-21模拟物和miR-21抑制剂后,western blot检测PTEN。(3)用5μM的Akt抑制剂(Akt inhibitorⅣ)预处理后,TGF-β1刺激细胞。用western blot检测Akt磷酸化,上皮标志蛋白(E-钙粘蛋白)、间皮标志蛋白(N-钙粘蛋白、波形蛋白)的表达。(4)100nMmiR-21模拟物转染人肝细胞株QSG-7701细胞后,加入5μM的Akt抑制剂(Akt inhibitorⅣ),western blot检测Akt磷酸化,上皮标志蛋白(E-钙粘蛋白)、间皮标志蛋白(N-钙粘蛋白、波形蛋白)的表达。结果1. TGF-β1刺激引起了人肝细胞的EMT(1) TGF-β1刺激引起了肝细胞形态改变,由原先多边形的紧密排列的上皮样细胞,变为细长纺锤样有较多触角的成纤维细胞状样细胞。(2) TGF-β1刺激引起了上皮标志蛋白(E-钙粘蛋白)表达下降。(3) TGF-β1刺激引起了间质标志蛋白(N-钙粘蛋白、波形蛋白)表达上升。2.TGF-β1刺激人肝细胞miR-21的表达：在TGF-β1刺激5天后miR-21的表达明显上升。3.MiR-21介导了TGF-β1的EMT作用。(1)转染miR-21抑制剂24小时后,miR-21的表达明显下降。(2)形态改变：miR-21抑制剂组较对照组性状更圆钝,触角更少,排列更紧密。(3)上皮标志蛋白(E-钙粘蛋白)较对照组表达升高。(4)间质标志蛋白(N-钙粘蛋白、波形蛋白)表达较对照组表达下降。以上结果提示下调miR-21表达后,阻断了TGF-β1致肝细胞EMT作用。4.miR-21转染直接刺激人肝细胞的EMT(1)转染miR-21模拟物24小时后,miR-21的表达明显增高。(2)miR-21模拟物转染组细胞形态较对照组变瘦长,触角更多,排列更松散。(3)miR-21模拟物转染组上皮标志蛋白(E-钙粘蛋白)较对照组表达下降。(4)miR-21模拟物转染组间质标志蛋白(N-钙粘蛋白、波形蛋白)表达较对照组下降。以上结果提示miR-21过表达可直接刺激人肝细胞的EMT5. PTEN/Akt通路介导了人肝细胞的EMT作用(1) TGF-β1调节了PTEN蛋白的表达：TGF-β1刺激细胞后PTEN表达下降。(2)miR-21调节了PTEN蛋白的表达：转染miR-21模拟物后PTEN表达下降,转染miR-21抑制剂后PTEN表达上升。(3)抑制Akt减少了TGF-β1的EMT作用：Akt抑制剂+TGF-β1组较TGF-β1组上皮标志蛋白(E-钙粘蛋白)表达升高。间质标志蛋白(N-钙粘蛋白、波形蛋白)表达下降。(4)抑制Akt减少了miR-21的EMT作用：Akt抑制剂+miR-21模拟物组较miR-21模拟物组上皮标志蛋白(E-钙粘蛋白)表达升高,间质标志蛋白(N-钙粘蛋白、波形蛋白)表达下降。结论MiR-21通过PTEN/Akt信号通路调节了肝细胞上皮间质转化。