第一部分AT1受体反义核酸对大鼠肾脏局部肾素-血管紧张素系统的阻断作用目的：局部肾素-血管紧张素系统(RAS)在肾脏疾病的发生发展中可能起着重要作用，但受到研究手段的限制，迄今尚未得到直接的证明，其机制也不完全清楚。本研究应用单侧肾脏基因转移的方法研究血管紧张素Ⅰ型受体(AT1)反义(AS)寡核苷酸(ODN)对大鼠肾脏局部RAS的阻断作用。方法：采用单侧肾动脉注射+原位电穿孔的方法，将AT1 AS-ODN导入到Wistar大鼠的一侧肾脏，以FIFC荧光标记的ODN观察其在肾脏的转移位置，以AT1放射自显影定量分析的方法观察转移基因的时间-效应曲线。在基因转移3天后以RT-PCR、Western blot及免疫组织化学方法检测肾脏AT1的mRNA和蛋白表达与分布，并以正义(Sen)ODN转移、假注射+肾脏原位电穿孔(Sham)作为对照。结果：FITC标记的ODN在基因转移10分钟后主要定位于转移侧肾脏的肾小球，而对侧肾脏FITC荧光阴性。AT1放射自显影定量分析显示在基因转移后的3天内，结合有血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)的AT1可较未转移的对侧肾脏减少约70％。AT1 AS-ODN基因转移后3天，转移侧肾脏AT1 mRNA水平较对侧肾脏下降约43％，蛋白水平下降约67％，而与AT1 Sen-ODN和Sham组转移侧肾脏比较AT1的mRNA水平下降分别约47％和51％，蛋白水平下降分别约63％和71％。免疫组化检查发现AT1的阻断以系膜区的表达减少为主。结论：本研究所用的单侧肾动脉注射+原位电穿孔的基因转移方法成功地抑制了单侧肾脏的肾小球AT1受体的表达，为研究全身性疾病肾损害中肾脏局部RAS的短期作用机制提供了一个比较理想的整体动物模型。第二部分AT1受体反义核酸单侧肾脏转移对糖尿病大鼠肾脏PKCβ活化的影响研究目的：PKC的激活被认为是促进糖尿病肾病发病的重要环节之一，既往的研究表明PKC的活化与RAS系统的激活有关，随着对局部RAS认识的深入，我们希望探讨PKC的活化是否与肾脏局部RAS的兴奋有关。本研究通过单侧肾动脉注射+肾脏原位电穿孔的方法将AT1受体的反义基因转移到糖尿病大鼠的单侧肾脏，阻断单侧肾脏的RAS系统，并与氯沙坦阻断循环RAS的兴奋做比较，了解PKC的活化与肾脏局部RAS激活的关系。方法：：wistar大鼠(150g左右)，链脲佐菌素STZ 60mg／kg腹腔注射诱导糖尿病模型，血糖＞16.7mmol／l作为成模标准，3周后分别给予(n=5)：AT1antisense ODN单侧肾动脉注射+肾脏原位电穿孔：AT1 sense-ODN单侧肾动脉注射+肾脏原位电穿孔；假注射+原位电穿孔；假注射+氯沙坦50mg／kg／d灌胃。试验前后测动物血压，3天后处死动物取肾脏，RT-PCR及Western blot检测双侧肾脏AT1 mRNA及蛋白表达，PKC的活化用胞膜与胞浆PKC蛋白表达的比例表不。结果：大鼠血压在氯沙坦组明显下降(P＜0.05)，其他各组血压无明显变化，ATlantisense注射组和氯沙坦组的AT1蛋白表达较正常对照组下降分别为70.1％和76％(p＜0.05)，PKC胞膜与胞浆蛋白表达比例在ATlantisense注射组和氯沙坦组均明显下降，较正常对照组下降分别为79.1％和74％(p＜0.05)。结论：肾脏局部RAS的激活可影响糖尿病大鼠肾脏PKC的活化，该效应不依赖于循环RAS的效应。第三部分AT1_A受体基因对糖尿病嵌合体小鼠肾脏细胞外基质重塑影响研究目的：探讨AT1_A受体基因对糖尿病嵌合体小鼠肾脏细胞外基质的影响。方法：嵌合体(chimeric)小鼠全身组织包括肾脏由血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)1A型受体(AT1_A)野生型细胞(AT1_A+／+)和AngⅡ受体AT1_A基因敲除细胞(AT1_A-／-)两组不同克隆来源的细胞组成。AT1_A嵌合体(Chimeric)小鼠，腹腔注射链尿佐菌素(STZ，300mg／kg)诱导糖尿病模型12周后，取肾脏组织，连续冰冻切片作LacZ(β半乳糖苷酶)染色区分不同基因型的肾小球和PAS染色检测其细胞外基质的表达；免疫组化方法检测转化生长因子TGFβ1、纤溶酶原激活物抑制物PAI1、终末糖基化产物AGE、硝基酪氨酸nitrotyrosine的表达，比较两种基因型肾小球细胞外基质和各细胞因子的表达变化。结果：在糖尿病状态下，(AT1_A+／+)和(AT1_A-／-)肾小球细胞外基质均较对照组明显增多(P＜0.05)。两种基因型相比，AT1A-／-基因型的表达绝对值均高于AT1_A+／+基因型肾小球(P＜0.05)，但从正常状态到糖尿病其升高幅度却低于AT1_A+／+基因型肾小球(P＜0.01)。各种细胞因子在糖尿病状态下的表达也都明显增加(P＜0.05)，AT1_A-／-基因型的绝对数值也均高于AT1_A+／+基因型肾小球(P＜0.05)，但变化幅度均为AT1_A-／-基因型肾小球低于AT1_A+／+基因型肾小球(P＜0.01)。结论：AT1_A基因缺失使得部分肾小球代偿性上调TGFβ1、PAI1、AGE和nitrotyrosine的表达。AT1_A受体在一定程度上影响了TGFβ1、PAI1、AGE和nitrotyrosine的表达而参与了糖尿病小鼠肾脏细胞外基质的重塑，但并非独立决定因素。第四部分AT1a基因敲除小鼠中肾脏局部RAS对糖尿病肾病的影响及其机制的探讨目的：探讨在AT1a基因敲除小鼠中肾脏局部RAS的改变对糖尿病肾脏细胞外基质合成的影响及其可能机制方法：AT1a基因敲除小鼠和野生型小鼠，腹腔注射链尿佐菌素(S7Z，300mg／kg)诱导糖尿病模型12周后，取肾脏组织，冰冻组织切片用激光捕获微切割的技术分离肾小球，提取RNA，结合Real-time PCR的方法检测肾小球内AT1a、AT1b，AT2，angiotensin，ACE，肾素renin，醛固酮合成酶CYP11B2的mRNA表达，观察AT1a基因敲除小鼠中肾脏局部RAS的改变；PAS染色观察肾脏病理变化，免疫组化方法检测转化生长因子TGFβ1、纤溶酶原激活物抑制物PA11、单核细胞趋化因子MCP1和Renin的表达，比较两种基因型肾小球细胞外基质和各细胞因子的表达变化。结果：与野生型小鼠相比，在AT1a基因敲除的糖尿病小鼠肾小球内AT1b，angiotensin，renin，CYP11B2的表达明显上调(p＜0.05)，在AT1a基因敲除的小鼠肾小球中未检测到AT2的表达，在野生型小鼠肾脏中检测到微量的表达，且在糖尿病状态下表达下调，ACE无明显改变；与正常小鼠相比，两种基因型的糖尿病小鼠肾脏细胞外基质和TGFβ1、PAI1、MCP1和Renin的表达均明显增加(p＜0.05)，AT1a基因敲除的糖尿病小鼠较野生型糖尿病小鼠的肾脏病变更严重。结论：AT1a基因敲除不能使小鼠糖尿病肾脏病变减轻，并使得TGFβ1、PAI1、MCP1和Renin的表达上调；AT1b的上调和AT2的下调可能使得血管紧张素Ⅱ的生物活性继续得以发挥，renin的上调可能通过非血管紧张素途径参与了糖尿病肾病的进展，CYP11B2的上调提示肾脏局部可能有非血管紧张素途径的醛固酮合成。第五部分AT1a基因敲除对糖尿病状态下肾小球足细胞及其相关蛋白的影响目的：探讨在AT1a基因敲除对糖尿病状态下肾小球足细胞及其骨架蛋白的影响。方法：AT1a基因敲除小鼠和野生型小鼠，腹腔注射链尿佐菌素(STZ，300mg／kg)诱导糖尿病模型12周后，取肾脏组织，冰冻组织切片用激光捕获微切割的技术分离肾小球，提取RNA，结合Real-time PCR的方法检测肾小球内nephrin和α-actinin 4的mRNA表达，免疫组织化学的方法检测足细胞标志WT1的表达，免疫荧光的方法观察AT1a基因敲除对nephrin和α-actinin 4蛋白表达和分布的影响。结果：与野生型小鼠相比，在AT1a基因敲除的糖尿病小鼠肾小球内足细胞的数目无明显改变，nephrin的mRNA表达明显减少(p＜0.05)，蛋白表达也明显减少，并由线状分布变为点状分布。两种基因型的α-actinin 4的mRNA和蛋白表达在糖尿病状态下均明显减少，但两种基因型之间无明显差异。结论：糖尿病状态下，足细胞的相关蛋白nephrin和α-actinin 4表达减少，AT1a基因敲除使得nephrin的mRNA和蛋白表达在糖尿病状态下减少更明显。足细胞数目未受到影响。