目的:胆囊癌诊断的金标准是苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,H-E)染色的病理组织学。然而该项传统技术过程具有相对比较费时、染色剂环境污染和着色问题等不足。新式的双光子激发荧光(two-photon excited fluorescence,TPEF)显微成像技术,基于细胞自身的荧光信号,对未染色组织切片成像能直接产生详细的组织结构和细胞形态学等特征,从而形成细胞水平的图像。本课题,利用TPEF显微镜对人类正常胆囊组织和三种分化程度不同胆囊癌的微结构进行成像,研究无H-E染色切片上的胆囊癌组织结构、细胞、细胞质和细胞核等形态学的改变,并辅以盲法试验,以探讨TPEF显微成像技术对胆囊癌诊断的可行性和意义。方法:首先,正常胆囊组织和三种分化程度不同胆囊癌的组织切片经脱蜡后行TPEF显微镜扫描成像,成像后标本经H-E染色、普通光学显微镜成像,TPEF图片与相应的H-E图片进行病理组织学比较;其次,通过对比三种分化程度不同胆囊癌的TPEF图片与正常胆囊组织的TPEF图片中组织学的改变,以及核和核仁面积的改变,建立胆囊癌的光学诊断特征;最后,28例石蜡切片进行盲法试验,评价TPEF显微成像技术对胆囊癌光学诊断的准确性。结果:TPEF显微镜能清晰成像分层的正常胆囊组织结构,包括粘膜层、肌层和浆膜层;典型的肿瘤细胞,以细胞和细胞核多形性、核增大和核仁扩大等为特征,也能经TPFE显微镜在无H-E染色的组织切片中识别出。根据组织形态学的差异,TPEF显微成像不但可以鉴别高、中、低分化胆囊癌的组织学和细胞学特征,而且可以区分胆囊癌细胞和正常细胞不同的核和核仁面积,TPEF图片和H-E图片具有可比性。在28例石蜡切片的盲法试验中,TPEF光学诊断的准确性为96.4%。结论:研究结果表明TPEF显微镜对石蜡切片进行成像,基于组织形态学的改变,具有区分胆囊癌和正常胆囊以及进一步区分三种分化类型胆囊癌的能力。本研究获得的TPEF成像结果不亚于H-E染色的病理成像,甚至在定位细胞核和核仁方面更优于传统H-E染色的病理学。同时,本研究为将来TPEF显微镜应用于胆囊癌的回顾性研究提供了实验基础。随着微小化和集成化的发展,非标记又无污染的TPEF显微成像将成为一种有效又可靠的辅助工具,从而为病理学诊断提供额外丰富的信息并获得更准确的诊断。