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研究目的血友病B(hemophilia B, HB)是凝血因子Ⅸ(factorⅨ, FⅨ)基因突变引起血浆FⅨ量的缺乏或质的缺陷所导致的一种X连锁隐性遗传性出血性疾病,在男性中的发病率约为1/30000,是一种严重危害人民健康的疾病。由于目前尚缺乏针对本病的根治措施,故开展基因诊断及携带者检出无疑是防止新的患儿出生、阻断有害基因传递、提高人口素质的一个有效手段。本研究旨在从基因水平对HB患者及携带者做出诊断,探讨HB的分子发病机制。方法1.采集3个无血缘关系的HB家系先证者及成员外周静脉血,提取基因组DNA。2.选择距离FⅨ2cM内的6个STR位点,采用多重PCR及荧光标记引物扩增各STR位点片段,检测先证者及其家系成员6个STR位点的基因多态性,进行家系遗传连锁分析。3.根据FⅨ基因序列,利用Primer 5软件共设计8对引物,采用PCR法对先证者及可疑携带者FⅨ基因8个外显子及其侧翼序列进行扩增,运用双脱氧链终止法在ABI 3700测序仪上对PCR产物进行测序,利用Chromas软件将测序结果与正常序列进行比对,寻找基因突变。结果1.联合6个STR位点对3个HB家系进行检测,根据先证者的基因型,共发现9名可疑携带者,她们均有一条与先证者同源的X染色体。但基因测序证实,家系1、3可疑携带者的FⅨ基因中并不存在与先证者相同的基因缺陷,结合先证者的临床和病史特点,考虑其基因缺陷可能由自发性突变产生。家系2可疑携带者的FⅨ基因中发现了与先证者相应位点相同的杂合突变,STR位点基因多态性检测结果与基因测序结果一致,说明先证者的基因缺陷遗传自其母亲。2.利用PCR法及基因测序技术,在3例先证者的FⅨ基因中均发现了相应的错义突变:家系1先证者外显子6发现G22119A(侧翼序列的剪切位点)点突变,家系2先证者外显子2发现G7932C(Glu8Asp)点突变,家系3先证者外显子8发现T32685C(Cys336Arg)点突变。G22119A发生在外显子6侧翼序列的剪切位点,使FⅨ不能被正常剪切,从而影响其正常生理功能。T32685C发生在外显子8,该部位编码丝氨酸蛋白酶催化区,存在FⅨ与FⅧ的结合位点,可能是由于氨基酸的改变影响了FⅨ蛋白在细胞内的合成与分泌,导致FⅨ功能缺陷。G7932C发生在外显子2,导致Glu突变为Asp,影响了FⅨ与Ca2+依赖性磷脂的结合。结论1. FⅨ基因缺陷是HB的分子发病机制。2.联合多个STR多态性位点对HB家系携带者进行间接诊断,是一种简便、有效、快捷的方法;但是,对于无家族史的散发家系来说,通过遗传连锁分析做出诊断时仍有可能出现误差。3.基因测序技术是诊断HB患者及携带者最直接、最精确的方法之一。研究目的血管性血友病(von Willebrand disease, vWD)是由于血管性血友病因子(von Willebrand factor, vWF)基因突变引起血浆中vWF数量减少或质量异常所导致的一组遗传性出血性疾病,呈常染色体遗传,发病率较高,约为10/10万。患者可有轻度或中度皮肤黏膜出血、鼻衄、胃肠道出血及外伤后出血不止等症状,女性常有月经过多。本研究从3例vWD患者的临床及基因诊断出发,探讨基因型与表现型的相关性,了解vWF蛋白结构与功能的关系,研究基因突变对vWF表达量及功能的影响,旨在从分子水平阐明vWD的发病机制。方法1.采集3例vWD患者外周静脉血,进行血浆vWF:Ag、FⅧ:C测定及RIPA实验和vWF多聚物分析,明确疾病性质及亚型。2.提取患者基因组DNA,应用PCR法扩增患者vWF基因全部52个外显子及其侧翼序列,产物经测序分析寻找突变位点。3.采用基于PCR的定点突变技术构建携带特定突变位点的突变型vWF质粒。4.以野生型质粒为对照,在COS-7细胞中表达突变型质粒,测定转染细胞上清液及裂解液中的vWF:Ag并进行统计学分析。结果1.与正常混合血浆比较,3例患者vWF:Ag、FⅧ:C、RIPA均不同程度降低。2.多聚物分析显示,患者1血浆vWF多聚物缺如,患者2 vWF大中分子量多聚物消失,患者3 vWF多聚物分布及形态正常。3.通过基因测序分析,在3例患者的vWF基因中均发现了相应的杂合性错义突变:患者1外显子37存在C6424T(L2142F)突变;患者2外显子28存在C4738G(L1580V)突变;患者3外显子26存在C3467T(T1156M)突变,其中C6424T(L2142F)在以往国际公开文献中未见报道。4.体外表达实验显示,与转染野生型pSVvWF细胞表达上清中的vWF:Ag比较,pSVvWF3467(T1156M)、pSVvWF4738(L1580V)及pSVvWF6424(L2142F)表达上清中的vWF:Ag均不同程度降低,差异有显著性(P值均<0.01)。与转染野生型pSVvWF细胞裂解液中的vWF:Ag比较,pSVvWF3467及pSVvWF4738裂解液中的vWF:Ag无明显变化(P值均>0.05);pSVvWF6424裂解液中的vWF:Ag显著降低,差异有显著性(P值<0.01)。共转染实验显示,pSVvWF3467(T1156M)+野生型pSVvWF表达上清中的vWF:Ag降低,裂解液中的vWF:Ag增加,差异有显著性(P值<0.01)。结论1. vWF基因突变是导致vWD发生的分子病理机制。2. T1156M突变具有显性抑制效应,影响了正常vWF的分泌;L1580V突变通过改变vWF的空间构象导致其对血浆中的vWF裂解酶异常敏感,属于GroupⅡ突变;L2142F突变导致vWF表达量降低,但降低程度与患者临床症状及实验室检查结果不符,推测患者为复合杂合子,其vWF基因的内含子区域或调控序列中可能存在其他未被发现的致病性突变。