【摘 要】
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酯类水解酶广泛应用于生产生活的各个领域,主要包括酯酶（羧酸酯酶,Esterase）和脂肪酶（三酰甘油水解酶,Lipase）,属于α/β水解酶超家族。酯类水解酶来源较广,在动物、植物、真菌和细菌中都大量存在,其中以微生物为主要来源。而且,酯类水解酶广泛存在于各种环境条件,包括高温、极寒、高盐、高碱等极端环境。由于极端环境下能够生存的微生物进化出了独特的催化机制以适应极端条件,因而,从中分离得到的酯类
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酯类水解酶广泛应用于生产生活的各个领域,主要包括酯酶（羧酸酯酶,Esterase）和脂肪酶（三酰甘油水解酶,Lipase）,属于α/β水解酶超家族。酯类水解酶来源较广,在动物、植物、真菌和细菌中都大量存在,其中以微生物为主要来源。而且,酯类水解酶广泛存在于各种环境条件,包括高温、极寒、高盐、高碱等极端环境。由于极端环境下能够生存的微生物进化出了独特的催化机制以适应极端条件,因而,从中分离得到的酯类水解酶一般具有独特的性质。随着生物信息学分析、测序技术和基因注释技术的发展,越来越多的新型酯类水解酶从极端环境的样本中被发掘出来。南极独特的气候条件,为新型酯酶的发掘提供了便利。本研究以分离自南极土壤中的细菌为研究对象,在其基因组中进行酯类水解酶基因的筛选,得到了三个编码新型酯类水解酶的基因,分别编码了Est19、Est33和Est1404这三个酯酶。通过异源表达和分离纯化,获得了纯酶,对其进行了生物信息学分析、酶学性质以及初步的催化性能研究。酯酶Est19属于HSL家族。该酶催化三联体为Ser155、Asp253和His282,其中Ser155位于GESAG基序上。该酶最适温度为40℃,最适底物为p NP-C6,最适p H为8.0。Est19对p NP-C6底物的催化效率（kcat/Km）为148.68 s-1m M-1。用Asp取代关键催化丝氨酸旁的Glu154（E154→D）,酶的活性和催化效率显著降低,而底物亲和力变化不大。野生型酶在10-60°C的温度范围内保持几乎完全的活性,而在0°C时仍保持约50%的活性。生物信息学分析表明Est19及其同源基因代表了HSL的一个新亚家族,我们将其命名为GESAG亚家族。Est19酯酶在较低温度条件下保持较高催化能力的特性和立体选择性表明它可能用于低温催化和手性催化。酯酶Est33的催化三联体由Ser94、Asp205和His233组成,其中Ser94位于保守的五肽基序GVSWG中。Est33在10-30℃时活性保持在25-100%,对p NP-C2（30°C,p H 7.5）的催化活性最高。丝氨酸改性试剂苯基甲基磺酰氟（PMSF,10 m M）抑制了Est33高达80%的活性,巯基试剂二硫醇苏糖醇（DTT,10 m M）可以显著激活该酶,达到原活性3.8倍。金属螯合剂（如EDTA）则无影响。结果表明,Est33具有适冷性,可以承受低温,能在较低温度条件下发挥催化作用。系统发育分析表明,Est33及其近缘同源蛋白与其他已知的酯酶家族成员不同,属于一个独立的类群,结合生化分析,我们将Est33鉴定为一个新的酯酶家族（XXI）。酯酶Est1404属于HSL家族。Est1404对短酰基链的酯类具有偏好性,其最适底物是p NP-C4。最适温度和p H分别为70℃和8.5。在70℃孵育两小时,Est1404的催化能力变化不大,95℃孵育两小时,活力减少也保持在20%以内。虽然Est1404的活力受到Zn2+的强烈抑制,但对其他金属离子的反应不明显,而且还对甲醇和乙醇等有机试剂展示出了良好的耐受。这表明该酶可能具有高温条件或有机试剂中的催化应用潜力。本研究筛选得到的三个酯酶表现出了完全不同的生物化学特征,展示出了独特的催化性能,存在一定的极端适应性。它们的发现和表征,进一步扩充了酯酶/脂肪酶的家族,对于我们从南极资源宝库中获取具有更高工业应用价值的新型酯类水解酶具有重要意义。
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