研究背景与目的成人骨髓来源MSCs是具有自我更新及多向分化能力的干细胞,能够分化成成骨细胞、软骨细胞、肌腱细胞、神经细胞、脂肪细胞、骼肌细胞等。由于具有多向分化能力,MSCs用于成骨不全、心肌梗塞、创面愈合等方面的治疗。在适当条件下,MSCs能诱导分化成成骨细胞,在骨重建中发挥重要作用。既往文献揭示在动物模型中骨髓来源MSCs能修复骨缺损。而且,MSCs多向分化潜能具有可塑性,MSCs还参与调控免疫反应,其作用与其活化程度相关。因此,揭示调控MSCs功能分子机制具有重要意义,包括细胞成活、增殖、分化和细胞因子分泌等。Toll-like receptor 4(TLR4)作为外来微生物免疫感受器,是目前研究最深入的TLR受体。TLR4广泛分布于免疫系统细胞表面。激活TLR4对免疫反应有重要作用,既能诱导先天免疫反应,又能促进针对病原的特异性免疫反应。成人骨髓来源MSCs同样表达功能性TLR4。激活TLR4信号能影响MSCs存活、分化、增殖、迁移、细胞因子分泌等。TLR4能识别革兰氏阴性细菌来源的脂多糖(LPS)。文献报道,LPS能通过防止氧化应激诱导凋亡保护MSCs,并通过TLR4激活PI3K/Akt信号通路促进MSCs增殖。也有文献报道LPS能促进成人MSCs成骨分化。然而,关于TLR4的功能,目前文献报导尚无统一结论,不同研究结果之间存在差异。需要在不同模型中深入探讨TLR4激活后MSCs细胞生物学变化。特别是TLR4调节MSCs增殖和分化的分子机制仍不清楚。Wingless proteins(Wnt)家族是一类富含半胱氨酸的糖蛋白,负责调节胚胎发育、细胞增殖、迁移、分化和死亡。近来发现,Wnt信号具有调节MSCs增殖和分化、控制MSCs细胞命运功能。而且,Wnt信号涉及成人MSCs的成骨分化和脂向分化。至今,已证明与MSCs干细胞特性相关的Wnt有Wnt3a、Wnt5a、Wnt6、Wnt10a和Wnt10b。Wnt5a具有诱导MSCs成骨分化、抑制脂向分化的作用。Wnt3a具有促进成人MSCs增殖、抑制成骨分化的作用。Wnt10b影响MSCs向成骨细胞还是脂肪细胞分化。内源性wnt6敲除后,脂肪前体细胞分化增加,成骨过程受到抑制。然而,tlr4和wnt交互作用,及它们在调节mscs增殖与分化作用不清。本实验中,我们应用tlr4配体lps激活骨髓来源mscs的tlr4,在体外研究tlr4激活对mscs存活、增殖、成骨分化和细胞因子分泌的具体作用。另外,我们检测tlr4激活过程中相关的wnt信号,及wnt3a和wnt5a在tlr4诱导mscs增殖、成骨分化和细胞因子分泌中的具体作用及机制。研究方法1.从6至8周雄性野生型和基因敲除小鼠股骨、胫骨获取骨髓细胞,培养体外野生型mscs和tlr4基因敲除mscs(tlr4-/-mscs),应用流式细胞仪结合单克隆抗体cd29、cd44、cd31和cd45检测细胞表面标志物鉴定mscs;应用pcr和电泳技术鉴定tlr4-/-mscs中tlr4基因敲除是否成功。2.应用cck-8试剂盒检测不同浓度lps处理后mscs的增殖作用。应用annexinv-fitc/pi染色和流式细胞仪检测1000ng/mllps对mscs存活的影响。应用cck-8试剂盒在不同时间检测相应浓度lps对mscs增殖作用的影响。应用edu技术验证lps对mscs增殖作用。3.1000ng/mllps处理后,在mscs成骨分化培养3,5,7天,应用alp试剂盒检测lps处理后mscs分化细胞中alp的活性变化,反应成骨分化情况;1000ng/mllps处理后,在mscs成骨分化培养7,15,20,25天,应用茜素红染色检测钙沉积,反应分化细胞成熟情况。4.为了观察lps对mscs分泌细胞因子的影响,1000ng/mllps处理后mscs培养3天。应用real-timepcr技术检测lps处理后mscs中il-6,il-1β和tnf-α三种细胞因子mrna水平,并应用elisa技术检测上清液中三种细胞因子蛋白水平。5.为了观察lps对tlr4受体的影响,1000ng/mllps处理后mscs培养3天。应用real-timepcr技术检测mscs中tlr4mrna水平,并应用westernblot技术检测细胞膜上tlr4蛋白表达水平。6.为了观察tlr4缺失后lps对mscs增殖的影响,1000ng/mllps处理后野生型mscs和tlr4-/-mscs分别培养6天。应用cck-8和edu技术检测tlr4-/-mscs增殖情况。7.为了观察tlr4缺失后lps对mscs成骨分化和成熟的影响,1000ng/mllps处理后野生型mscs和tlr4-/-mscs分别骨向诱导培养3,5,7天,应用alp试剂盒检测tlp活性。1000ng/mllps处理后野生型mscs和tlr4-/-mscs分别骨向诱导培养7,15,25天,应用茜素红染色技术检测钙沉积情况。8.为了观察tlr4基因缺失后lps对mscs细胞分泌的影响,1000ng/mllps分别处理后野生型mscs和tlr4-/-mscs骨向诱导培养3天,应用real-timepcr技术分别检测il-1β和il-6mrna表达水平。9.lps处理mscs后3天,应用real-time检测wnt3a、wnt5a、wnt6、wnt10a和wnt10bmrna水平,筛选表达水平变化的wnt。10.分别在lps处理mscs1、2、3天,应用real-timepcr分别检测wnt3a和wnt5amrna表达变化情况,同时应用elisa技术分别检测上清液中wntt3a和wnt5a蛋白变化情况,观察lps刺激对mscs表达wnt3a和wnt5a的影响。11.为了观察tlr4基因缺失后lps对wnt3a和wnt5a表达的影响,1000ng/mllps分别处理后野生型mscs和tlr4-/-mscs培养1、2、3天,应用real-timepcr检测wnt3a和wnt5amrna表达情况,应用elisa检测上清液中wnt3a和wnt5a蛋白水平。12.基于rna干扰技术,分别将特异性wnt3a和wnt5asirna转染到mscs内。转染后2、4天,应用real-timepcr分别检测wnt3a和wnt5amrna的表达水平。13.为了观察wnt3a和wnt5a在lps诱导mscs细胞因子分泌中的作用,分别将wnt3a或wnt5asirna转染到野生型mscs内。1000ng/mllps处理mscs后培养2、4天,应用real-timepcr检测il-1β和il-6mrna表达情况。14.为了观察wnt3a和wnt5a在lps诱导mscs增殖中的作用,分别将wnt3a或wnt5asirna转染到野生型mscs内。1000ng/mllps处理mscs后培养6天,应用cck-8试剂盒和edu技术检测细胞增殖情况。15.为了观察wnt3a和wnt5a在lps诱导mscs成骨分化和成熟中的作用,分别将wnt3a或wnt5asirna转染到野生型mscs内。1000ng/mllps处理mscs后培养7天,应用alp试剂盒检测mscs分化细胞alp活性。1000ng/mllps处理mscs后培养15天,应用茜素红染色技术检测mscs分化细胞成骨分化和成熟情况。研究结果1.几乎所有体外培养的野生型和tlr4-/-mscs表面均表达cd29和cd44,而不表达cd31和cd45。在体外成功构建了野生型mscs和tlr4基因敲除mscs(tlr4-/-mscs)模型,为后续实验奠定了基础。2.1000ng/mllps处理后6天,没有发现细胞死亡增加。这说明浓度为1000ng/ml的lps对mscs死亡没有影响,不影响其存活,可作为后续实验浓度。3.lps促进mscs增殖,且与剂量和时间呈正相关。浓度为100和1000ng/ml的lps具有促进mscs增殖的作用,1000ng/ml作用更为明显。lps处理后第2天开始mscs增殖显著增加,且随着时间延长增殖作用更明显。4.lps促进mscs成骨分化和成熟。lps处理后5,7天,分化细胞中的alp活性明显增加,提示lps促进mscs成骨分化。lps处理后15天开始钙沉积作用比对照组明显增加,并随时间延长增加更明显,提示lps促进mscs分化细胞成熟。5.1000ng/mllps处理3天后,il-6和il-1βmrna表达均上调。elisa检测同样发现lps处理3天后培养液中il-6和il-1β蛋白量明显增加。然而,lps处理后tnf-αmrna和蛋白均无明显变化。6.1000ng/mllps处理3天后,tlr4mrna和蛋白水平均明显上调。7.lps处理6天后tlr4-/-mscs增殖无明显影响。未处理的tlr4-/-mscs和野生型mscs之间增殖无明显影响。这些结果提示lps通过激活tlr4受体促进mscs增殖;tlr4基因敲除没有明显抑制mscs正常增殖。8.lps处理7、15、25天后,tlr4-/-细胞分化后钙沉积与对照组无明显差别。lps处理3、5、7天后,lps组alp活性物明显差别。这些结果提示,lps通过激活tlr4受体促进mscs成骨分化与成熟。9.tlr4基因敲除后,lps促进mscs分泌细胞因子作用消失,提示lps通过激活tlr4受体促进mscs分泌细胞因子。10.lps处理后3天,wnt3a、wnt5a、wnt6、wnt10a和wnt10bmrna表达,只有wnt3a和wnt5a表达上调。lps处理后1、2、3天,wnt3a和wnt5amrna表达均上调。而且,培养液中wnt3a和wnt5a蛋白浓度随时间延长明显增加。11.lps处理后,wnt3a和wnt5amrna在tlr4-/-mscs中表达没有明显增加,提示lps通过激活tlr4受体促进wnt3a和wnt5a表达。12.wnt3a和wnt5a阻断不影响lps诱导mscs分泌il-6和il-1β,提示wnt3a和wnt5a不参与tlr4受体诱导的细胞因子分泌过程。13.阻断wnt3a显著抑制lps对mscs的增殖作用,而阻断wnt5a几乎不影响lps对mscs的增殖作用。这些结果提示,wnt3a在tlr4受体介导的mscs增殖中发挥重要作用,而wnt5则在mscs增殖过程中无明显作用。14.阻断wnt3a不影响lps诱导的alp活性和钙沉积增加。阻断wnt5a则明显拮抗lps诱导的alp活性和钙沉积作用。这些结果提示,wnt5a参与tlr4受体介导的mscs成骨分化与成熟,而wnt3a则与mscs成骨分化无明显相关。结论1.LPS具有诱导骨髓来源MSCs增殖、成骨分化和细胞因子分泌的作用,当TLR4基因缺失时,LPS对MSCs的增殖、成骨分化和细胞因子分泌的作用消失。说明LPS通过激活TLR4受体促进MSCs增殖、成骨分化和细胞因子分泌。2.LPS能诱导野生型MSCs上调Wnt3a和Wnt5a水平,当TLR4基因缺失时,LPS上调Wnt3a和Wnt5a的作用消失。说明LPS通过激活TLR4受体诱导MSCs分泌Wnt3a和Wnt5a。TLR4受体通过上调Wnt3a表达水平促进MSCs增殖,通过上调Wnt5a表达水平促进MSCs成骨分化与成熟。而TLR4受体促进MSCs分泌细胞因子与Wnt3a和Wnt5a表达无关,可能存在另外的通路。