单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism,SNP）为一种特殊的遗传位标,对人类医学研究和法医学鉴定等方面具有重要意义。随着人类对全基因组序列信息的深入研究,人们对SNP分型技术有了一定的需求,其中传统的检测方法包括:一代测序技术、连接酶检测技术、PCR-RFLP技术等。这些检测方法虽然准确率高,但单次检测位点少、步骤繁琐且耗时费力等问题,严重阻碍了它们的大规模推广。随着基因检测技术的推陈出新,陆续出现了第二代测序技术（Next-Generation Sequencing,NGS）、数字PCR技术以及基于实时荧光定量PCR平台（染料法检测、探针法以及高分辨率熔解曲线法）的检测技术等,这些方法具有不同的优势,但其方案开发过程复杂、成本较高等,使这些检测方法难以进行全面的推广。本研究开发了一种新型的基因分型方案,用来解决当前基因分型技术面临的问题。本研究利用发夹引物和通用荧光引物进行分型,可以对样本进行快速、准确、低成本的检测。本方案的优势如下:（1）使用发夹引物提高特异性,产生尽可能少的引物二聚体和非特异性扩增。本研究依据等位基因特异性PCR（Allele Specific PCR,AS-PCR）原理设计了具有特殊结构的发夹引物,能够有效解决由于引物与引物之间相互作用产生引物二聚体,导致扩增效率低的问题;也能够有效的减少引物与模板间产生错配,导致非特异扩增的现象。（2）运用引物竞争性原理,提高准确性。对同一位点的两种基因型各设计一条发夹引物,扩增时,利用两引物之间的竞争关系,提高准确性。（3）结合通用荧光引物的使用,可实现单次对多个位点的分型。本研究利用发夹引物和通用荧光引物建立的分型方案,可以检测与叶酸代谢相关的基因（MTHFR基因的C677T和A1298C、MTRR基因的A66G）。发夹引物从5’至3’端依次包括成发夹序列、通用荧光引物结合序列和特异序列。所谓发夹是由于5’端的成发夹序列与3’端的特异序列约有10-13个碱基可以互补,形成的结构为发夹状。在扩增过程中,对于特异性的模板,发夹引物将打开与模板的目标序列结合,进行稳定扩增;反之,对于非特异性的模板,发夹引物不会打开,有效抑制了非特异性产物的产生。发夹引物中间的通用荧光引物结合序列与荧光基团标记的通用荧光引物的序列相同,当发夹引物与模板结合进行几个循环产生一定量的产物后,通用荧光引物将与产物结合进行大量扩增,使最终产物都标记了荧光基团,可在毛细管电泳平台上进行其长度大小的检测和基因型的判断。综上所述,本实验将发夹引物和通用荧光引物结合使用,对与叶酸代谢相关的位点进行基因分型。此方案是一种时耗短、价格低、特异性高以及可实现单管多位点检测的基因分型方案。