第一部分根皮苷对db/db小鼠视网膜保护作用的研究研究背景糖尿病(diabetes mellitus, DM)是一种由于胰岛素抵抗伴有相对胰岛素不足或胰岛素分泌的缺陷而导致的以慢性血葡萄糖水平增高为特征的代谢性疾病。近年来,随着生活水平的提高、生活方式的改变以及人口的老龄化,DM的患病率在全球范围内呈现逐步增高的趋势,业已成为严重威胁人类生命健康与生活质量的世界性公共卫生问题。DM不仅仅表现为持续的血糖代谢紊乱,更重要的是其可以导致机体大血管与微血管的严重损害。DM视网膜病变是DM微血管病变最常见的并发症之一,也是最为严重的DM眼部并发症。几乎所有的1型DM与超过半数的2型DM患者最终均会发展并导致DM视网膜病变。在发达的工业化国家,DM的视网膜病变是成人中获得性视力损害与失明的最重要的病因。与非DM人群比较,DM患者致盲的危险性升高25倍。由于DM流行趋势的影响,近年来与DM伴行的DM视网膜病变同样严重并备受重视。迄今为止,针对DM视网膜病变的防治手段主要集中于代谢危险因素的控制(如)严格控制血糖、血压等)以及眼的局部治疗(如药物、激光与手术治疗等)。然而,上述治疗方法均受限于局部并发症与治疗效果的困扰,并不能完全阻断视网膜病变的发展。因此,在临床实践中迫切需要寻找防治DM视网膜病变的新型药物与途径,旨在进一步完善与充实DM视网膜病变的治疗策略。根皮苷(phlorizn,PHL)是根皮素(phloretin)的2‘-β-D-葡萄糖苷,属于植物黄酮类中的二氢查尔酮苷。PHL作为苹果多酚中的重要组分,主要有在于苹果属的多种植物中,在植物的根、茎、叶与果实中均有分布。大量研究结果表明,PHL具有多种生物活性与药理作用,如抗炎,抗肿瘤,抗氧化,以及降低血糖与改善认知等。近年来,PHL已经作为新型的候选药物应用于DM血管并发症的基础研究中。动物实验发现,PHL以显著改善InsAkitaDM小鼠的心室肥厚与心室重塑。PHL还可以明显抑制db/db小鼠的主动脉病变与肝损害。还有证据表明,在STD诱发的DM大鼠中,PHL可以显著减少其蛋白尿,改善其肾小球的高滤过状态。PHL的衍生物T-1095能够明显降低db/db小鼠的蛋白尿,提示PHL具有DM肾脏病变的保护作用。但是,PHL是否对于db/db小鼠视网膜病变具有保护作用,目前国内外未见报道。本研究应用目前较为普遍认可的db/db小鼠作为2型DM的动物模型,采用脱氧核桃核苷酸末端转移酶介导的的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)检测db/db上鼠视网膜中审经元药细胞与血管内皮细胞与血管内皮细胞的凋亡特征,并检测视网膜神经胶质细胞胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达变化以评价db/db小鼠视网膜的病变损伤。同时检测糖原合成酶激酶3β(GSK3β)蛋白以及磷酸化糖原合成酶激酶3β(phospho-GSK3β)蛋白在视网膜组织的表达。本研究旨在观察天然药物PHL.对于db/db小鼠视网膜病变的影响,初步并探讨PHL实现其保护作用的可能分子机制,从为临床上治疗DM慢性血秘并发症提供新的治疗思路与途径。研究目的1.研究db/db小鼠视网膜组细胞的凋亡以及视网膜GFAP的表达等视网膜病变早.期阶段的特点：2.研究PHL对于db/db小鼠视网膜强胞凋亡视网膜GFAP表达的影响，评价PHL对于db/db小鼠视网膜的保护作用；3.研究PHL对于GSK3β蛋白与phospho-GSK3β蛋白在视网膜组织表达的影响。初步探讨PHL对db/db小鼠视网膜保护作用的机制，为开辟DM视网膜病变治疗的新途径完善理论基础。研究方法7周龄性C57BLKS/J db/db小鼠16只,以及7周龄雄性C57BLKS/J db/m小鼠8只,均由南京大学模式动物研究所提供。正式实验开始前所有小鼠均予观察1周。实验开始后分组,C57BLKS/J db/m小鼠8只作为正常对照组(CC), C57BLKS/J db/db小鼠随机分为两组：一组随机8只小鼠为DM模型组(DM),每日予生理盐水灌胃；另一组随机8只为PHL干预组(DMT), PHL20mg/kg/d溶液灌胃(与DM组生理盐水体积相同),共进行10周。实验期间每周定期测量体重(BW)并记录。实验周期结束,所有小鼠空腹过夜并处死。采血检测空腹血糖(FBG),糖基化终末代谢产物(AGEs)等指标。并迅速摘除眼球,多聚甲醛固定后并常规分离视网膜,按照病理取材常规制作视网膜石蜡切片。然后应用TUNEL法检测视网膜细胞凋亡情况,并应用蛋白质免疫印迹(western blotting)技术分析GFAP蛋白、GSK3β蛋白与phospho-GSK3β蛋白在视网膜组织的表达。部分视网膜组织分离后立即于液氮速冻后-80°保存留待进一步蛋白质组学实验用。研究结果1.一般观察CC组小鼠生长以及精神状况良好,活跃,毛发光顺。DM组小鼠实验进程中,逐渐表现为污秽无泽,被毛蓬松,少动,明显多饮、多食、多尿,体重快速增加。DMT组小鼠上述表现有所改善。2.PHL对db/db小鼠体重、FBG与AGEs的影响实验开始DM组与DMT组的体重差异并无统计学意义(P>0.05),但均显著高于CC组(P<0.01)。自实验第2周开始, DM组小鼠体重逐渐增加,该趋势一直持续至实验结束(即实验第10周)。然而,DMT组小鼠与DM组相比,体重表现为明显下降(P<0.01)。实验开始时DM组与DMT组间的FBG与AGEs水平无显著性差异(P>0.05),但与CC组比较,两组FBG与AGEs水平均明显升高(P<0.05)。给予PHL干预10周后,DMT组小鼠的FBG与AGEs水平与DM组比较则明显降低(P<O.05)。3.PHL对db/db小鼠视网膜细胞凋亡的影响实验结束后,于TUNEL法以及苏木素-伊红(HE)染色复染检测小鼠视网膜细胞的凋亡,以细胞核棕黄(褐)色染色结果判定为阳性细胞。三组实验小组同样条件下至少各计数10个视野的凋亡细胞,以凋亡细胞与细胞总数的比值表示。结果发现,CC组小鼠视网膜未见明显细胞凋亡,正常细胞核在HE复染后呈蓝色,细胞核形态、大小较一致。与CC组比较,DM组小鼠视网膜TUNEL-阳性细胞的数量显著增加(P<0.01),凋亡细胞的细胞核中出现棕黄色或者棕褐色颗粒，细胞核形态不规则,大小不一,且多位于视网膜神经节细胞与血管内皮细胞。DMT组小鼠视网膜与DM组小鼠相比较,PHL治疗后,其视网膜凋亡细胞数量明显减少(P<0.01)。4．PHL对db/db小鼠视网膜GFAP表达的影响Western blotting染色显示,实验结束时,CC组小鼠视网膜组织GFAP显色反应最弱,含量最低。DM组视网膜组织GFAP表达明显增高,PHL治疗后,GFAP表达则显著降低,但仍明显强于对照组。5.PHL对db/db小鼠视网膜GSK3β蛋白与phospho-GSK3β蛋白表达的影响Western blotting染色显示,实验结束时,与CC组小鼠视网膜组织phospho-GSK3β蛋白表达相比较DM组视网膜组织phospho-GSK3β蛋白表达明显减少。经PHL治疗后,phospho-GSK3β蛋白表达则显著增高。结论1.与正常对照组比较,db/db小鼠随年龄增长其体重显著增加,PHL干预可以显著改善db/db小鼠的肥胖。2.db/db小鼠的FBG与AGI水平较正常对照组显著升高,经PHL治疗后能够显著降低其FBG与AGEs水平。3.PHL治疗可以显著减少db/db小鼠视网膜凋亡细胞的数量,抑制db/db小鼠视网膜组织GEAP的过量表达,提示PHL对于db/db小鼠视网膜的保护作用。4.PHL可以通过减少phospho-GSK3β蛋白表达,抑制GSK3β蛋白活性的途，减轻db/db小鼠视网膜的细胞凋亡,起到保护其视网膜病变的作用。第二部分基于iTRAQ定量蛋白质组学技术探讨根皮苷对db/db小鼠视网膜的保护机制研究背景人类基因组计划的重大研究成果——人类基因组序列图谱的完成,宣告了生命科学研究经步入了一个新的纪元——“后基因组时代(postgenome era)"的到来。人们认识到,基因仅仅只是遗传信息的源头与载体,而功能性蛋白才是基因功能的执行者,是生命现象的直接体现者。对蛋白质结构与功能的研究将直接阐明生命在生理或病理状态下的变化机制。然而,传统的对单个蛋白质进行研究的方式已经无法满足功能基因组时代的要求。因此,必须需要在整体、动态、网络的水平上进行探讨,才能揭示生命现象的本质。由此,蛋白质组学应运而生,它是以细胞内或是一种基因组的全部蛋白质及其活动方式为研究对象。可以说,蛋白质组学研究的开展不仅是生命科学研究进入后基因组时代的里程碑,也是后基因组时代生命科学研究的重点内容之一。随着蛋白质组学研究的不断深入与发展,人们已经不再满足于对一个混合体系中的蛋白质进行简单的定性分析。蛋白质组从静态的定性分析发展到动态变化的定量研究,于是有学者提出“定量蛋白质组学(quantitative proteomics)"的概念。定量蛋白质组学是功能蛋白质组学中的重要内容之一,就是把一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂的混合体系中所有蛋白质进行精确地定量与鉴定。定量蛋白质组学着重于定量解析细胞蛋白质的动态变化与动态行为,进而真实的反映了细胞功能、过程机制等综合信息。因此,定量蛋白质组学常被用于分析疾病与健康、药物处理前后蛋白质中的差异蛋白的确定,并有助于发现新的生物功能、可用于鉴定诊断或预警的疾病标志物和发现用于疾病治疗的靶标蛋白质。近年来该领域发展非常迅速,全新的应用和方法设计正在不断推进着技术创新。近年来出现的一种基于质谱的蛋白质组学定量分析技术即同位素标记的相对和绝对定量技术(isobaric tag for relative and absolute quantification, iTRAQ)以其独特的优越性,正逐渐成为定量研究中的主要方法之一。iTRAQ相对定量技术为开展针对特定细胞或状态机制等的研究提供了一种差减分析的工具,最终可以提供上调或者下调蛋白质的功能信息,其将在探讨疾病的发生机制、疾病标志物的寻找、药物靶标的鉴定以及新药的研发与利用等研究领域得到很好的应用PHL是一种天然多酚类化合物,广泛存在于苹果属的多种植物中。大量研究发现,PHL具有多种生物活性、药理作用与临床功效,如抗氧化损伤、清除自由基、调节血糖与血压、保护心脏、抗肿瘤以及改善认知等等。已有研究结果提示,PHL对于DM心肌肥厚、主动脉病变、肾脏蛋白尿、视网膜早期周细胞损伤等DM大血管与微血管病变具有改善作用。本课题第一部分研究也发现：PHL于db/db小鼠视网膜具有明显的保护作用。然而,目前尚未明确PHL保护DM视网膜病变的作用机制以及分子靶点。药物研发的过程中需要特别重视药物治疗、蛋白质表达和生理反应之间存在的密切关系。绝大多数情况下,药物治疗会导致基因产物表达的调控与修饰。同样,复杂的疾病过程如DM的代谢紊乱也会引起蛋白质表达的改变。为此,可以推断理想的药物有能力将受扰系统的整体蛋白质表达恢复至正常状态的水平。传统意义上的药物研究往往注重药物表型的观察与单个大分子或酶解的活性,无法实现对于药物的药理活检的检测以及药物作用的靶点的全面分析。随着定量蛋白质组学与药学研究的共同发展与结合,为药物高效率开发与利用带来了新的希望。在实际应用中,定量蛋白质组学可以实现高高通量的对比分析药物作用前后蛋白质表达谱或者蛋白质表达丰度的改变,从而详尽的阐明药物的作用机制并可以发现与确认药物作用的靶点,揭示药物作用环节与作用过程。这些无疑将大大有助于理性高效的的开展药物研发工作,为药物研制提供新的思路与途径。本研究第二部分将应用iTRAQ蛋白质组学相对定量技术,并利用Turbo SEQUEST欠件与国际蛋白质索引(international protein index, IPI)数据库检索等生物信息学方法,分离与鉴定正常对照组(CC组),db/db小鼠组(DM组)与db/db小鼠PHL治疗组(DMT组)等小鼠视网膜组织的差异农达蛋白,旨在探讨PHL对于db/db小鼠视网膜病变的保护机制与作用靶点,为临床上DM视网膜病变的治疗寻找和研发展有效的药物而提供蛋白质靶标,希望有助于理性高效的为治疗DM视网膜病变而开展药物研发工作。研究目的1.初步探讨db/db小鼠视网膜病变的差异表达蛋白的特征,进一步了解DM视网膜病变的发病机制：2.探讨db/db小鼠经PHL治疗后视网膜组织的差异表达蛋白，并筛选以及初步验证药物作用的关键蛋白与侯选靶标,基于蛋白质组学角度进一步揭示PHL对于DM视网膜的保护机制,从而为开辟DM视网膜病变的治疗的新途径奠定理论基础。研究方法从正常对照组、db/db小鼠与PHL干预db/db三组小鼠中各选取4只,分离视网膜组织。按照蛋白质组学样本制备标准技术流程,包括视网膜组织的研磨、切碎、超声破碎、裂解等流程来提取视网膜总蛋白,并以Bradford蛋白质定量法测定蛋白质浓度,分装提取样品,-80°保存备用。提取各组视网膜总蛋白后,各组上样20ug样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),观察各组之间电泳后蛋白点迁移平行度较好后,再采用iTRAQ定量蛋白质组学技术。各组视网膜总蛋白采用FASP酶解得到相应各组肽段。各组取60ug肽段,按照ABI公司说明书操作与标记消化后的各组肽段,依次分别为114标记正常对照组,116标记PHL干预组,117则标记db/db组。标记结束后,各组均随机选取一定数量肽段,利用ABI4800MALDI-TOF/TOF质谱仪检测其二级质谱图中低分子量端是否存在相应质量标记试剂,确定标记成功后将各组已标记的肽段混合,然后用AgilentHPLC1200强阳离子交换柱(strong cation exchange, SCX)进行分离分级,收集穿流以及洗脱部分合并成10组,之后予C18Cartridge脱盐进行下一步质谱鉴定。本研究第二部分使用Thermo Finnigan LTQ Velos质谱仪进行液相质谱-串联质谱分析(LC-ESI-MS/MS)。质谱仪在线配备0.15mm*150mm C-18反相色谱柱,液相A液为0.1%甲酸水溶液,B液为0.1%甲酸乙腈水溶液(乙腈为84%)。质谱的进样方式为Microspray,毛细管温度为200度,检测方式为正离子。多肽和多肽的碎片的质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描(full scan)后采集5个碎片图谱(MS2scan)。原始文件(raw file)用iTRAQ Result Multiple File Distiller分析定量数据,并用SEQUEST软件鉴定多肽分子。最后,使用相关软件将定量及鉴定结果进行合并处理,得到定量和鉴定结果。定量方法采用Identified iTRAQ Statistic Builder软件分析,采用软件计算的ratio_biweight值作为蛋白质定量结果,以114标记为内参。搜索使用的数据库为ipi. MOUSE. v3.72. REVERSED. fasta蛋白库(SEQUEST结果过滤参数为：Protein FDR≤0.01; Peptide FDR≤0.01)。应用EXPASY蛋白质组学工具分析等电点、分子量等。并采用基因本体论GO (http://amigo.geneontology.org/cgi-bin/amigo/go.cgi,Version1.8)对经鉴定的视网膜蛋白质功能进行分类,从分子功能(Molecular function)、生物过程(Biological process)与细胞组成(Cellular component)三个方面对蛋白质表达谱进行定位分类与功能分析。并将筛选出的部分差异蛋白用western blotting方法给予进一步验证其在视网膜组织中的表达。研究结果1.质潜鉴定结果经LC-ESI-MS/MS鉴定并予软件分析、数据库检索,共鉴定出蛋白1651种,符合鉴定条件者可信蛋白636中,具有唯一肽段8972个。其中鉴定db/db小鼠组与正常对照组视网膜的差异表达蛋白348个,db/db小鼠视网膜组织表达上调的点177个,下调的点171个。另外,经PHL.治疗后有60个回调的差异农达蛋白,其中PHL治疗后下调33个点,上调27个点。2.PHL干预后差异蛋白的定位分析对于PHL干预后的60个差异蛋白点,予采用基因本体论GO进行定位分析。结果发现，PHL干预后的差异蛋白包括胞浆蛋白、核蛋白、膜蛋白、内质网蛋白与线粒粒体蛋白等,其中以胞浆蛋白与核蛋白为主,均占33.87%其中γ晶体蛋白(γ-crystallin)位于胞浆以及胞核内,谷氧还蛋白(glutaredoxin-3)位于胞浆中。3.PHL干预后差异蛋白的功能分析对于PHL干预后的60个差异蛋白点,根据有知识、数据库注释与文献资料,采用基因本体论GO进行功能分析。结果发现,PHL干预后的60个差异蛋白点,其功能涉及到信号转导、细胞骨架、细胞代谢、凋亡、氧化应激等等,其中参与细胞代谢占55%,比例相对最大。4.筛选的部分差异蛋白在宙网膜组织的表达改变以验证为验证蛋白质组学鉴定出的差异蛋白在视网膜组织的表达,应用western blotting方法检检其中部分差异蛋白如γ晶体蛋白(γ=crystallin)与谷氧还蛋白(glutaredoxin-3)在各组小鼠视网膜组织中的表达。结果显示,与正常对照组小鼠视网膜中表达比较,γ晶体蛋白在DM小鼠中表达明显增高。然而，应用PHL治疗后,表达增高的γ晶体蛋白有所下调。另外,谷氧还蛋白在db/db小鼠中表达与正常对照组比较明显降低,经过PHL干预后该蛋白表达回调,因此,γ晶体蛋白与谷氧还蛋白的蛋白免疫印迹。实验结果均与TRAQ鉴定结果是一致的。结论1.作为蛋白质组学的新颖技术iTRAQ,具有高灵敏性、高通量的特点,能够对于多组样本同时进行比较分析,可以获得更好的蛋白质组覆盖率。因此,iTRAQ能够用于研究PHL对db/db小鼠视网膜保护作用的分子机制,并助于发现新的药物靶标。2.应用LC-ESI-MS/MS鉴定得到PHL干预db/db小鼠视网膜差异表达蛋白60个,其中表达下调33个,表达上调27个,均以胞浆蛋白为主。差异蛋白其功能涉及到信号转导、细胞骨架、细胞代谢、凋亡与氧化应激等等,提示这些过程与机制可能参与了DM视网膜的发生与发展。3.在差异表达蛋白中,以正常对照小鼠视网膜作为对照,蛋白质免疫印迹方法发现,γ晶体蛋白在db/db小鼠组明显上调,在PHL干预组则显著下调；相反,谷氧还蛋白在db/db小鼠明显下调,在PHL干预组则显著上调。该结果与质谱数据解析结果一致,提示Y晶体蛋白与谷氧还蛋白可能是PHL对db/db小鼠视网膜保护作用的候选的关键蛋白。4.本研究提供了PHL对于db/db小鼠视网膜保护作用的蛋白质表达谱的重要信息,为全面揭示PHL作用机制带来重要手段与思路,同时为寻找DM视网膜病变的治疗提供了可能有意义的药物靶标,从而为临床诊治DM视网膜病变奠定与充实崭新的理论基础。