长久以来人类做了不懈的努力去认清结核病漫长致病过程中发生的事件以及结核病原菌与宿主之间隐蔽复杂的关系,试图能在结核病防控困境中寻找新的突破口。结核病早期感染事件关连着宿主的先天性防御,影响着获得性免疫应答的方向。结核分枝杆早期分泌蛋白是感染早期事件中的重要效应分子,对它们的深入认识有助于为结核病的治疗、疫苗设计、早期诊断提供新的思路。存在于结核分枝杆菌早期分泌蛋白中的ESX家族成员是一群极有意思的小分子量蛋白,它们因显著的T细胞免疫原性倍受关注,曾是候选疫苗和诊断试剂热点研究靶区,其中极个别的蛋白已用于商业诊断或处于临床疫苗试验中;它们在疾病进程中作用重大但功能不明;它们之间相似的遗传特征及在G+中广泛存在性提示ESX家族蛋白具有普遍生物学意义;它们独特的分泌方式,代表着的G+新型分泌途径的T7S是近几年来揭起的极具竞争力的研究命题。所属ESX家族成员的TB10.4蛋白,是结核分枝杆菌生存必不可少的因子,并在致病过程中发挥重大作用,同时也是知之甚少的T7S/ESX-3系统的核心分泌蛋白。　　 本课题采用原核表达不同标签的TB10.4融合蛋白产物作为单抗制备的免疫原和检测原,依照小鼠源性单克隆抗体经典制备流程筛选到8株稳定的TB10.4杂交瘤细胞系,其中有4株细胞株能与真核表达的TB10.4蛋白反应,这4株单抗有望为研究TB10.4分子在早期感染事件发挥的生物学功能、分子活动方式及T7S/ESX-3分泌机制功能提供有价值的工具。　　 一.结核分枝杆菌TB10.4原核表达和鉴定　　 构建携带两种融合标签的TB10.4原核表达重组载体pET-30(a)+-esxH和pGEX-6P-1-esxH。提取测序正确的重组载体转化表达宿主菌BL21(DE3),对经抗生素选择培养出的重组BL21(DE3)(pET-30(a)+-esxH)BL21(DE3)(pGEX-6P-1-esxH)进行小量诱导表达;SDS-PAGE检测目的表达产物,对正确表达的重组菌蛋白表达条件进行优化;在蛋白表达优化条件下,大量诱导表达TB10.4融合蛋白,应用针对TB10.4融合标签的亲和层析柱纯化获得带6×His和GST标签的TB10.4蛋白,纯化的HIS-TB10.4和GST-TB10.4可分别作为TB10.4单克隆抗体研制的免疫原和检测原。从而为后续实验的开展提供了必要的生物材料。　　 二.TB10.4单克隆抗体制备及特性鉴定　　 以免疫原HIS-TB10.4免疫小鼠制取多抗血清,GST-TB10.4包被ELISA板棋盘滴定试验建立用于TB10.4单克隆抗体筛选的间接ELISA方法。单抗制备小鼠采用脾内免疫法,免疫原与弗氏完全佐剂乳化充分后,经皮下途径免疫BALB/c小鼠,每只100μg,21天后,进行脾内免疫,每只20μg,后三天取脾脏融合,依据经典小鼠源单克隆抗体程序,最终筛选出8株稳定分泌TB10.4单克隆抗体的杂交瘤细胞系。8株单抗均识别原核表达的TB10.4蛋白,表现出良好的特异性,其中的4株单抗能识别重组腺病毒表达的TB10.4蛋白。单抗亚型鉴定均为IgG1,制备的单抗腹水效价达到1×105-1×106的数量级。　　 这些研制的单抗将在获取天然TB10.4蛋白,追踪TB10.4早期感染发生的分子事件,研究ESX-3分泌机制的构造成分及活动方式等方面发挥实际作用。