论文部分内容阅读
MicroRNA (miRNA)是生物体内普遍存在的一种内源、非编码、小分子量的单链RNA分子,其前体具有茎-环结构。具有高度保守性、时序性和组织特异性。成熟miRNA通过与靶mRNA特异性的碱基互补配对,在转录后水平介导靶mRNA降解或翻译抑制来调控基因表达。相对动物而言,植物miRNA的研究起步较晚,但由于miRNA研究技术的不断发展,新发现的植物miRNA的数量呈倍数增长。2010年9月份miRbase数据库释放了Release 16.0版本,公布3070个植物miRNA,其中双子叶植物1769个miRNA,单子叶植物887个miRNA。到目前为止,对植物miRNA的研究主要集中在基因组已被解析的拟南芥、水稻等模式植物上,而很少对非模式植物的miRNA进行研究,在miRbase数据库中还没有木薯miRNA的相关信息。本研究分析了GenBank中已公布的拟南芥中miR319、393、402和miR172的功能,将鉴定具有提高植物耐寒性功能的miRNAs转入木薯,在此基础上进一步从木薯中分离了与耐寒相关的miRNAs,结果如下：1、从拟南芥中分离了miR319c、393b、402和miR172c,并通过生物信息学预测了miR172c的20个靶基因,niR319c的14个靶基因,miR393b的8个靶基因,miR402的2个靶基因。2、构建了pVKH-35S-miR172c-pA、pVKH-35S-miR319b+402+393c-pA两种植物表达载体,并转入拟南芥中。研究发现,在长日照下,miR172高表达转基因拟南芥比野生型拟南芥提前20天开花,并且不影响植物的正常生长发育。将miR319、393、402串联高表达于拟南芥植物中,转基因拟南芥和野生型拟南芥于4℃下弱光培养40天,pVKH-35S-miR319+402+393-pA高表达转基因拟南芥除部分果夹和种子发育不正常外,表型无明显变化,而野生型拟南芥叶片大量变黄,并逐渐死亡。说明miR319、393、402串联在一起,能提高植物的耐寒性。3、本研究采用比较基因组学的方法,根据miRbase数据库中已公布的miR172、miR319、miR393、miR402序列,设计特异性引物,通过PCR获得了木薯miR172、miR319a、miR319c、miR393、miR402的前体序列,长度分别为124bp、176bp、179bp、96bp、121bp,并将其进行二级结构折叠,都可以形成发夹结构。再利用前体序列推测出miRNA的成熟序列,木薯miR172成熟序列为5’-agaaucuugaugaugcugcau-3’。木薯miR319a成熟序列为5’-uuggacugaagg gagcucccu-3’,木薯miR319c成熟序列为5’-uuggacugaagggagcuccuu-3’,木薯miR393成熟序列为5’-uccaaagggaucgcauugauc-3’,木薯miR402成熟序列为5’-uucgaggccuauuaaacctgga-3’。4、木薯是世界三大薯类作物之一,具有全年可种植、易栽培、高度耐旱、产量高等优良特性,在热带地区广为种植。但是作为典型的热带植物,温度是其生长的重要限制性因子。通过转基因技术,将pVKH-35S-miR319+402+393-pA植物表达载体转入木薯“华南8号”中,经PCR检测,得到4个阳性株系。