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骨桥蛋白(Osteopontin, OPN)是一种磷酸化的酸性糖蛋白,存在于哺乳动物组织和体液中。OPN可诱导矿化骨基质的成熟,调节羟基磷灰石的形成,促进矿化组织的重建,防止骨密度的下降。我们在进行OPN如何促进骨骼重建的研究过程中,发现纯化获得的牛乳骨桥蛋白与蛋白质数据库中的牛乳骨桥蛋白略有差别。为此,本研究旨在利用OPN能抑制草酸钙晶体生长的生物特性,来鉴定分离纯化得到的OPN。OPN抑制草酸钙晶体生长的分析结果与SDS电泳分析结果一致,证明纯化得到的目的蛋白具有OPN的特点。从而为研究OPN与骨代谢等关系奠定基础。目前对于应用现有的仪器手段分析来源于牛乳的OPN的二级结构仍为空白,至今尚不能给出其测定的精确结构。本研究应用傅里叶红外光谱对纯化的OPN进行二级结构具体地分析,可以给出OPN二级结构中螺旋、转角等各个构象的情况。对于OPN的结构与功能关系的研究具有重要的指导意义。本研究主要从以下方面对牛乳OPN进行研究:第一,对牛乳OPN进行反相层析、去除酪蛋白等纯化工艺优化;第二,SDS-PAGE分析各层析洗脱峰,同时根据OPN抑制草酸钙晶体生长活性作用对各层析洗脱峰进行再鉴定研究;第三,进行各纯化步骤洗脱峰OPN含量测定,终产品(OPN)纯度测定;第四,对纯化冻干后样品进行傅里叶红外光谱二级结构测定。具体结果如下:⒈纯化工艺优化及其再鉴定结果表明,在DEAE-Sephacel离子交换与Phenyl-Sepharose疏水层析之间做去除酪蛋白处理后,疏水层析结束时得到的OPN组分均一,由常规的SDS-PAGE条带得到很好证实。最后根据OPN抑制草酸钙晶体生长的生物活性,鉴定出经过SOURCE 5RPC ST反相作用层析的两个洗脱峰均有晶体生长抑制活性,推断其分别为OPN的不同分子片段。并根据草酸钙晶体生长溶液上清液中钙离子浓度的变化,采用原子吸收法定量测定了OPN抑制草酸钙晶体生长的剂量-效应曲线,得出当抑制晶体生长率达到50﹪时所需要的纯化的OPN浓度约为24 nM。⒉根据Bradford测定法测定的总蛋白含量,以及ELISA法测定OPN的含量,得出从1 L原料乳乳中经过优化了的纯化步骤后,可得到OPN 8.98 mg,纯度为0.556 mg/mg蛋白。⒊利用傅里叶红外光谱对分离纯化的OPN冻干粉进行二级结构测定,结合去卷积及二阶导数拟合处理,分析牛乳中纯化的OPN二级结构近似含α-螺旋:70﹪;β-折叠:30﹪。本研究结果证明,应用OPN对晶体生长活性抑制作用并结合电泳实验很好地鉴定了各步纯化过程中目的蛋白(OPN)所在洗脱峰的位置,从而不仅为体外研究其活性作用提供原材料纯化的技术路线,为工业化提取牛乳OPN提供技术参数支持,同时也为其添加到各种保健食品药品中作为功能因子预防及治疗相关症状提供可能。对OPN二级结构研究为其三级结构研究奠定基础,同时为研究其结构-功能相互关系提供依据。