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研究目的:采用RNA干扰技术逆转人卵巢癌OVCAR8/TR细胞中多药耐药基因,探讨该技术能否有效地抑制多药耐药基因MDR1的表达,降低该基因编码的糖蛋白P-gp的水平,以期恢复耐药细胞对化疗药物的敏感性。
方法:设计合成针对MDR1的小片段RNA(siRNA),将合成的siRNA用脂质体转染具有多药耐药基因MDR1高表达的人卵巢癌泰素耐药细胞株OVCAR8/TR,用荧光定量RT-PCR检测转染后不同时间点的MDR1的mRNA的变化,流式细胞仪定量测定转染后不同时间点P-gp表达的情况,ATP生物发光法检测转染后细胞对顺铂、5-氟脲嘧啶、阿霉素和泰素四种化疗药物敏感性的变化。
结果:1.MDR1的siRNA转染细胞24、48、72、96、120小时后,荧光定量RT-PCR检测的MDR1的mRNA的量与未转染细胞相比分别减少了26.42%、84%、78.43%、45.85%、0%,在转染后的48小时基因的抑制达最高,以后则逐渐回升,在转染的第五天回到正常水平。阴性对照组mRNA的量与未转染组的mRNA的量无差异。
2.转染后的24、48、72、96、120小时,流式细胞仪定量测定的蛋白抑制率分别为16.71%、49.64%、85.23%、65.98%、9.44%,在转染后的72小时其蛋白的抑制最强,至第五天时恢复接近正常水平,阴性对照组蛋白表达与未转染组的蛋白表达无差异。
3.ATP生物发光法药敏检测显示,OVCAR8/TR细胞对5-氟脲嘧啶敏感,而对顺铂、阿霉素和泰素均不敏感,转染后细胞能够明显提高对泰素和阿霉素的敏感性,而对顺铂的耐药性则无改变。泰素对细胞的抑制率由转染前的26%提高到78%,阿霉素对细胞的抑制率则由转染前的37%提高到58%。单用脂质体转染组的药敏结果与未转染组无统计学差异。
结论:本实验结果显示卵巢癌细胞中存在有RNA干扰现象,siRNA能够有效地抑制多药耐药基因MDR1的mRNA和P-gp的表达,也能够恢复通过P-gp转运的化疗药物的敏感性。RNA干扰能够逆转人卵巢癌化疗药物的多药耐药,给治疗肿瘤耐药带来了新的希望。