脂肪的沉积包含脂肪细胞增殖、分化和聚酯成熟,该过程受到多种转录因子和脂肪分泌因子的级联调控。而且脂肪组织在体内的沉积和分布是影响胴体品质和肉质风味的关键因素。因此,研究脂肪分泌因子在脂肪细胞增殖分化过程中的作用机理,对家畜的肉质改良有着重要的意义。CTRP6是一种脂肪分泌因子,属于补体C1q/肿瘤坏死因子相关蛋白家族,其蛋白结构与脂联素极其相似。研究表明,在ob/ob小鼠和脂联素敲除鼠的脂肪组织和血清中,CTRP6的含量显著上升,然而PPARγ的激动剂-罗格列酮却能显著抑制CTRP6在脂肪组织中的表达。此外,CTRP6还可增强骨骼肌细胞AMPK/ACC的磷酸化,促进脂肪酸的氧化。本实验室前期研究发现,在3T3-L1脂肪细胞分化过程中CTRP6的表达丰度发生显著变化。根据以上研究结果,推测CTRP6可能在猪肌内和皮下脂肪细胞增殖分化过程中发挥重要作用。为了验证CTRP6的细胞学功能,利用流式细胞术、Elisa、荧光素酶报告分析、油红O染色、real-time qPCR和Western blot等细胞分子生物学技术,检测了CTRP6在猪肌内和皮下脂肪细胞增殖分化过程中的表达规律,以及CTRP6对细胞的增殖、分化和相关信号通路的影响。并且采用CoIP技术、Erk1/2和p38信号通路特异性抑制剂处理的方法,明确了CTRP6在肌内和皮下脂肪细胞增殖分化过程中的作用机制。为了完善试验结果,我们又从活体水平探讨了CTRP6对白色和棕色脂肪组织的作用。获得结果如下:1.在猪肌内和皮下脂肪细胞增殖分化过程中,CTRP6表达量随着细胞的增殖而降低,并且主要存在于脂肪细胞的胞质中。肌内脂肪细胞诱导分化后,CTRP6 mRNA的表达量逐渐升高,在分化第4d达到最高峰,然后进入“平台期”。在皮下脂肪细胞分化过程中CTRP6的表达量持续上升。2.构建猪CTRP6基因慢病毒表达载体,获得CTRP6-shRNA慢病毒,滴度为6.2×107pfu/ml,其能够显著抑制脂肪细胞中CTRP6的表达量。在此基础上,研究表明干扰CTRP6对脂肪细胞的增殖起到促进作用,主要体现在增加了细胞周期蛋白基因CyclinB和CyclinE的表达。在脂肪细胞分化过程中,干扰CTRP6能够显著减少细胞内的脂质积累(P<0.01),抑制脂肪细胞的分化,降低成脂关键基因的mRNA和蛋白水平,同时提高脂解基因ATGL mRNA的表达量(P<0.05)。3.在肌内和皮下脂肪细胞中,外源加入CTRP6重组蛋白可有效的抑制细胞的增殖,显著促进细胞的分化和脂质积累(P<0.01),提高脂肪细胞分化标志因子PPARγ和aP2mRNA及蛋白的表达量。4.MicroRNA-29a通过靶基因CTRP6调节猪肌内和皮下脂肪细胞的增殖分化。在转染miR-29a agomir之后,添加外源CTRP6重组蛋白,能够减缓miR-29a对脂肪细胞的作用。5.CTRP6通过Erk1/2和p38MAPK信号通路调控肌内和皮下脂肪细胞的分化,以及皮下脂肪细胞的增殖。在肌内脂肪细胞增殖过程中,CTRP6则主要作用于p38MAPK信号通路。此外在肌内脂肪细胞中,CTRP6能够与AdipoR1形成复合物。6.对小鼠腹腔注射pLentiH1-CTRP6-shRNAm慢病毒,可实现对小鼠组织和血清中CTRP6干扰作用。与对照组相比,干扰CTRP6的表达可显著降低小鼠体重及白色脂肪组织的重量(P<0.01),但不影响其摄食量。同时,干扰CTRP6能显著下调脂肪组织中脂肪细胞的大小(P<0.01),这主要是由于脂肪组织发生棕色化而造成的。并且CTRP6表达量的降低,可提高小鼠胰岛素敏感性和葡萄糖耐受性,调节血清中Adiponectin、Leptin和TG含量。综上所述,在猪肌内和皮下脂肪细胞中CTRP6是miR-29a的靶基因,miR-29a可调节CTRP6的表达量;CTRP6通过MAPK信号通路调控脂肪细胞的增殖与分化;并且在猪肌内脂肪细胞中,AdipoR1是CTRP6的受体,CTRP6通过AdipoR1作用于下游信号通路。此外,活体试验表明干扰CTRP6可提高胰岛素敏感性,增强葡萄糖耐受性,促进白脂棕色化以及棕色脂肪的形成。