随着纳米科技的迅速发展和纳米材料的广泛应用,人们在社会生产和日常生活中对各种纳米材料的暴露机会日益增多。由于纳米颗粒具有特殊的理化性质,可能产生与常规物质不同的生物学效应。因此,纳米材料的生物安全性问题受到广泛关注。本课题选择应用广泛的两种纳米材料:纳米二氧化硅(nm-SiO2)和碳纳米管(CNTs),分别研究其生殖毒性和肝肾毒性效应。纳米SiO2是目前世界上规模化工业生产产量最高的一种纳米粉体材料,其产品已广泛应用于化工材料以及生物医学等领域。以石英为代表的微米级结晶型SiO2已被证实对人体有很大危害。纳米SiO2的安全性研究也引起了人们的重视,目前关于纳米SiO2的生物安全性研究的报道,主要集中于对呼吸系统的整体及细胞毒性的作用,关于纳米SiO2对生殖功能损伤作用的报道较少。碳纳米管是最早进行大规模工业化生产的一种纳米材料,在日常生活和生物医学等领域也得到了广泛应用。关于CNTs的毒性效应的研究较为全面和深入,但应用代谢组学技术研究CNTs肝肾毒性效应的报道较少。代谢组学是继基因组学和蛋白质组学发展起来的一种组学技术,可以用于研究化学物引起的内源性代谢物变化,能够直接地反映体内生化状态的改变。本课题第一部分,研究纳米SiO2对雄性大鼠的生殖功能的损伤效应,并与微米粒径SiO2比较,探讨颗粒粒径对毒性效应的影响;第二部分,应用代谢组学技术研究CNTs对雄性大鼠的肝肾毒性作用及机制。为纳米SiO2和CNTs的安全性评价提供实验依据。1.纳米二氧化硅对雄性大鼠生殖毒性效应研究:选取纳米二氧化硅(nm-SiO2)和微米二氧化硅(μm-SiO2),用生理盐水制备染毒悬液,气管滴注法染毒雄性Wistar大鼠。大鼠随机分为5组:生理盐水对照组、高低剂量nm-SiO2组、高低剂量μm-SiO2组。高剂量组为7.5 mg/ kg BW,低剂量组为1.5 mg/ kg BW,隔日染毒1次,共染毒5周。(1)观察染毒对大鼠附睾精子的影响。精子评价是分析雄性生殖功能的重要指标。结果显示,对照组相比,高低剂量nm-SiO2组及高剂量μm-SiO2组精子数量均显著降低;高剂量nm-SiO2组及高剂量μm-SiO2组精子活动率降低;各染毒组精子畸形率均降低。提示染毒造成了精子功能障碍,并且影响了精子的发生和成熟。在低剂量水平,nm-SiO2较μm-SiO2损伤更为严重。(2)观察了染毒后大鼠睾丸组织及肺组织形态学的变化。结果显示大鼠睾丸组织形态基本正常,大鼠肺组织产生炎症损伤。说明染毒尚未对睾丸组织造成实质性损伤。(3)观察染毒对大鼠生殖功能相关激素和酶的影响。染毒后,与对照组相比,高低剂量nm-SiO2组及高剂量μm-SiO2组血清及组织中睾酮(T)含量均显著降低;高剂量nm-SiO2组及高剂量μm-SiO2组卵泡刺激素(FSH)含量升高。说明睾丸间质细胞和支持细胞功能受到损伤,影响了激素的合成和分泌,干扰了下丘脑-垂体-睾丸轴(hypothalamic-pituitary-testicular axis,HPTA)的调节作用。同时,睾丸组织中睾丸功能标志酶的活性也发生了改变:高剂量nm-SiO2组乳酸脱氢酶(LDH)、高剂量nm-SiO2组及高剂量μm-SiO2组琥珀酸脱氢酶(SDH)活性均降低,提示染毒影响了精子线粒体的功能。(4)检测睾丸组织以及血清中氧化损伤指标的变化。关于纳米材料所产生的生物效应机制,目前主要关注的是氧化应激作用。本实验中,与对照组相比,染毒后高剂量nm-SiO2组及高剂量μm-SiO2组(MDA)含量升高;高剂量nm-SiO2组超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力降低。说明SiO2对大鼠睾丸组织产生氧化损伤作用,进而破坏了睾丸和附睾的结构,对精子造成损伤并导致生精功能的障碍。(5)对睾丸细胞进行了流式细胞分析,检测生精细胞凋亡率及细胞类型的变化。结果显示,与对照组相比,染毒后高低剂量nm-SiO2组及高剂量μm-SiO2组细胞凋亡率升高;同时高低剂量nm-SiO2组及高剂量μm-SiO2组单倍体细胞减少,四倍体细胞增加;高剂量nm-SiO2组及高剂量μm-SiO2组G0/G1期细胞比例减小,G2/M期细胞比例增大。说明SiO2可能对大鼠生精细胞的有丝分裂产生抑制作用,阻滞了细胞周期进程,诱导生精细胞凋亡。(6)雄鼠染毒后与正常成年雌鼠按1:2合笼交配,于妊娠第20天各组处死一半雌鼠,检查胎鼠情况;另一半雌鼠自然分娩,检查仔鼠情况。结果显示,与对照组相比,染毒后高低剂量nm-SiO2组大鼠交配率及所产胎鼠数量显著降低,各组胎鼠及仔鼠生长发育指标无显著差异。说明纳米SiO2对雄性大鼠染毒影响了大鼠交配及胚胎形成,可以影响动物交配以及胚胎形成,但对于成功受孕后的胎鼠影响不明显。实验结果说明SiO2染毒后对大鼠睾丸组织造成了氧化损伤作用,影响了生殖器官的结构、代谢,从而改变精子生存的内环境,并且影响了性激素的合成和分泌,损伤生精细胞,诱导生精细胞凋亡。本实验条件下,在高剂量水平,nm-SiO2与μm-SiO2均造成各指标的改变,但在低剂量水平时,与μm-SiO2相比,nm-SiO2表现出更为严重的损伤作用。2.应用代谢组学技术研究CNTs对大鼠的肝肾毒性作用用生理盐水制备CNTs染毒悬液,气管滴注法染毒雄性Wistar大鼠。大鼠随即分为四组,高剂量组为22.5 mg/ kg BW,中剂量组为15 mg/ kg BW,低剂量组为7.5 mg/ kg BW,生理盐水作为对照组。每日染毒1次,连续染毒15次。(1)大鼠肝肾功能相关生化指标检测及肝肾组织学观察。染毒后与对照组相比,高剂量组白蛋白(ALB)、碱性磷酸酶(ALP)、总蛋白(TP)含量均显著降低;中剂量组TP含量显著降低;低剂量组谷草转氨酶(AST)含量显著降低。各组尿酸(UA)、肌酐(CR)、尿素氮(BUN)含量无显著差异。各组大鼠肝脏病理切片观察,各染毒组可见小灶性炎细胞,肝细胞脂肪变性,高剂量组可见部分肝细胞肿胀,肝灶性坏死。各组大鼠肾脏病理切片未见明显异常改变。(2)观察大鼠尿液代谢表型的变化。染毒后收集24h尿液,制备分析样品,运用NMR测定1H核磁共振谱,对数据进行积分后采用PLS-DA分析法进行分析。结果表明,CNTs染毒后大鼠尿液代谢组在得分图中呈聚类型分布,说明在CNTs的作用下,大鼠尿液代谢组模式出现了显著变化。与对照组相比,染毒组乙酸和氧化三甲胺的浓度增加,几种三羧酸循环中间产物(2-酮戊二酸、琥珀酸、柠檬酸)和肌酐浓度降低。(3)观察大鼠血浆代谢表型的变化。结果表明,CNTs染毒后大鼠血浆代谢组在得分图中呈聚类型分布,说明在CNTs的作用下,大鼠血浆代谢组模式出现了显著变化,与对照组相比,染毒组乳酸、胆碱、O-乙酰糖蛋白含量升高,而血糖、血脂、低密度脂蛋白含量降低。说明CNTs染毒后肝脏糖酵解过程加强,肝脏脂肪酸β氧化过程产生的乙酰CoA不能完全进入三羧酸循环氧化产能,从而转向生成酮体。(4)观察大鼠肝组织代谢表型的变化。结果表明,CNTs染毒后大鼠肝脏代谢组在得分图中呈聚类型分布,但高剂量组和低剂量组基本重合。说明在CNTs的作用下,大鼠尿液代谢组模式出现了显著变化,但剂量效应并不明显。与对照组相比,染毒组乳酸、糖和糖原、多不饱和脂肪酸含量降低;TMAO、胆碱、磷酸胆碱含量升高。(5)观察大鼠肾组织代谢表型的变化。结果表明,CNTs染毒后大鼠肾脏代谢组在得分图中呈聚类型分布,说明在CNTs的作用下,大鼠尿液代谢组模式出现了显著变化,与对照组相比,染毒组乳酸、TMAO、甜菜碱、胆碱和磷酸胆碱以及多不饱和脂肪酸含量升高,而β-葡萄糖含量降低。综合本部分实验结果,说明肝脏和肾脏是大鼠暴露于CNTs后的潜在靶器官。CNTs对肝肾组织的毒性作用与能量代谢中糖酵解、三羧酸循环的改变有关,与线粒体的功能降低和脂肪代谢的改变有关。代谢组学技术检测CNTs染毒后机体代谢成分变化较常规生化分析有明显优势,与模式识别技术相结合更有利于筛选出早期损害的代谢标志物。