巨噬细胞作为机体固有免疫重要的一员,在生理或病理状态的各个阶段都发挥了十分关键的作用。在肿瘤组织中,巨噬细胞的浸润比例高达70%,因此巨噬细胞在肿瘤发生发展过程中发挥至关重要作用。巨噬细胞可以通过多种方式杀伤肿瘤,首先巨噬细胞能够通过释放TNF-α、IL-6等促炎因子来杀伤肿瘤细胞;其次巨噬细胞通过直接接触来吞噬和杀伤肿瘤细胞;再有巨噬细胞作为重要的抗原提呈细胞,能够激活适应性免疫应答。然而巨噬细胞对肿瘤杀伤作用的分子机制仍不明确,而有关巨噬细胞杀伤肿瘤的机制也是肿瘤免疫相关领域亟待解决的关键科学问题。本课题组前期研究发现,卡介苗（BCG）激活的巨噬细胞具有明显的抗肿瘤作用,尤其是对纤维肉瘤MCA207细胞,并且这一过程与其细胞膜表面特有的某些蛋白分子密切相关,通过蛋白质组学的方法对BCG和硫乙醇酸盐（TG）诱导活化的巨噬细胞的膜蛋白进行检测和比对,我们得到了454个在BCG激活的巨噬细胞膜表面上调表达的蛋白。通过生物信息学预测,我们从中选取了可能参与巨噬细胞定向分化及细胞间接触且功能尚不明确的几个蛋白,TRIM59则为其中一个蛋白。TRIM59也称为小鼠ring finger蛋白1（Mrf1）,属于三重基序（TRIM）家族。TRIM家族是一个进化保守的基因家族,参与机体多种生理、病理进程,例如抗病毒感染、细胞分化和癌症等。但是到目前为止,大多数TRIM家族成员的功能尚未确定,他们通常具有典型的RING finger、B box和coiled-coil（RBCC）结构域,具有介导蛋白质之间相互作用的功能。除RBCC结构域外,TRIM13和TRIM59还具有跨膜区。这些结构特征使TRIM59可能成为BCG活化的巨噬细胞（BAM）与靶细胞之间分子-分子相互作用的中间体。研究表明,TRIM59在多种肿瘤中高表达,发挥促进肿瘤细胞增殖、转移等作用,被认为是潜在的促肿瘤因子。同时也有研究发现,TRIM59可以调节固有免疫应答。我们课题组前期研究还发现,TRIM59参与了BCG活化的巨噬细胞介导的细胞毒性作用。但目前TRIM59在巨噬细胞中的功能及其分子调控机制尚不清楚。为了揭示TRIM59在巨噬细胞中的作用和意义,我们从以下三个部分展开研究:第一部分TRIM59调控的巨噬细胞对肿瘤发生发展的影响首先对TRIM59在多种肿瘤细胞中的表达进行分析,发现并不是所有肿瘤细胞中TRIM59的表达均处于较高水平,如在纤维肉瘤和黑色素瘤中TRIM59表达均较低。接下来,通过运用巨噬细胞特异性敲除TRIM59的小鼠（TRIM59-CKO）进行体内实验,发现巨噬细胞中TRIM59缺失的情况下,肿瘤明显增大,并且巨噬细胞中TRIM59的缺失导致肿瘤局部巨噬细胞浸润的减少,且巨噬细胞主要表现为M2型。此外脾脏和淋巴结中的细胞毒性T细胞和B细胞不受TRIM59的影响。这些结果表明高表达TRIM59的巨噬细胞主要对肿瘤表现出细胞毒性作用。在体外,我们将经1%多聚甲醛固定的高表达TRIM59的巨噬细胞与多种肿瘤细胞共培养,高表达TRIM59的巨噬细胞对MCA207有明显的直接接触杀伤作用,这种作用在使用TRIM59中和抗体处理后明显减弱。而采用高表达TRIM59的巨噬细胞培养上清与多种肿瘤细胞共培养后,我们发现TRIM59上调的巨噬细胞培养上清对MCA207纤维肉瘤细胞无明显杀伤作用,但对黑色素瘤等肿瘤细胞则有较明显的细胞毒性。这表明TRIM59调控的巨噬细胞对不同肿瘤的杀伤方式可能不同。第二部分TRIM59调控的巨噬细胞对纤维肉瘤的直接杀伤作用及机制分析我们发现BCG的确能够引起巨噬细胞中TRIM59的高表达,并且TRIM59主要分布在巨噬细胞膜上。在第一部分结果的基础上,我们进一步探讨了TRIM59调控的巨噬细胞对MCA207纤维肉瘤细胞的杀伤作用,发现高表达TRIM59的巨噬细胞对MCA207纤维肉瘤的生长有明显抑制作用,并能够诱导肿瘤细胞凋亡。此外,与高表达TRIM59的巨噬细胞共培养的MCA207细胞的PI3K/Akt途径被显著抑制,而与TRIM59-CKO巨噬细胞共培养后,MCA207细胞中PI3K/Akt途径的激活不受影响。这些结果表明,TRIM59是BCG活化的巨噬细胞介导的抗肿瘤作用的重要效应分子,将可能成为治疗纤维肉瘤的新靶点。第三部分TRIM59调控的巨噬细胞对黑色素瘤转移的影响及机制分析在第一部分结果中我们观察到TRIM59-CKO小鼠体内黑色素瘤明显增大,并且高表达TRIM59的巨噬细胞培养上清对黑色素瘤具有显著的细胞毒性作用,但机制尚不清楚。我们首先检测了TRIM59-CKO小鼠肿瘤内巨噬细胞的表型,发现B16肿瘤内巨噬细胞也主要表现为M2型。为了模拟小鼠肿瘤微环境,我们将对照小鼠和TRIM59-CKO小鼠的巨噬细胞在体外极化为M2型,并收集了各自的培养上清作为条件培养基（CM）处理黑色素瘤细胞,结果发现,TRIM59^-/--M2型巨噬细胞培养上清显著促进了B16-F0和B16-F10细胞的迁移和侵袭,并且TRIM59^-/--M2型巨噬细胞培养上清中的TNF-α的水平增加了约15倍。通过转录组测序分析,我们发现TRIM59^-/--M2型巨噬细胞培养上清能够促进黑色素瘤细胞中Mmp-9和Madcam1的表达,并且呈现出TNF-α依赖性。通过对下游可能的通路进行分析,发现其激活了肿瘤的ERK信号传导通路。另外,分别敲低B16-F10细胞中的Mmp9和Madcam1能够抑制其上皮-间充质转化过程,并减少了体内皮下肿瘤的生长和转移性肺结节的形成。这些数据表明肿瘤相关的巨噬细胞中TRIM59表达的减弱促进了黑色素瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。这些结果提示巨噬细胞中TRIM59作为肿瘤转移的潜在调节剂的关键作用,TRIM59将有望成为癌症免疫治疗的新靶标。