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随着高能量交通事故发生率的增高,股骨头骨折发生率也随之增高。现阶段随着对股骨头骨折损伤机制、手术入路的研究不断深入,使手术治疗水平不断提高,鉴于早期关节置换面临假体松动、多次翻修等问题,具备手术指征的患者多强调早期切开复位内固定,恢复髋关节的解剖和功能。但股骨头骨折病例分散、单中心样本数量较少,手术入路复杂多样、不同术者之间异质性较大,增加了股骨头骨折切开复位内固定临床疗效相关研究的难度,骨不连、创伤性关节炎、股骨头坏死、异位骨化等股骨头骨折并发症仍是医生及患者面临的难题。作为再生医学的明星“种子细胞”——骨髓间充质干细胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)是具有多向分化能力的非造血干细胞,在不同的诱导因素下可向软骨细胞和成骨细胞分化,通过促进成骨和血管生成治疗骨不连。AMPK/SIRT1信号通路参与细胞自噬、细胞增殖和分化、蛋白质合成和降解、凋亡、肿瘤、炎症和衰老,机械拉伸通过激活该信号通路诱导人骨髓间充质干细胞的抗氧化反应和成骨分化。此外,具有抗过敏、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤、抗血小板聚集、降血压等作用黄酮类化合物——槲皮素已被证实可以促进骨髓间充质干细胞成骨分化和血管生成因子表达,但背后的详细机制仍不清楚。因此,本研究选择临床和基础两个角度,探讨切开复位内固定治疗股骨头骨折的临床疗效以及槲皮素对骨髓间充质干细胞(BMSCs)的调控机制。第一部分 切开复位内固定治疗股骨头骨折的疗效评价目的探讨切开复位内固定治疗股骨头骨折的临床疗效。方法采用回顾性病例系列研究分析2014年6月~2020年6月因股骨头骨折于郑州大学第一附属医院急诊外科接受切开复位内固定治疗的股骨头骨折患者的临床资料,根据术前X线片、CT平扫、CT三维重建,明确骨折Pipkin分型,评估骨折严重程度,制定手术入路,统计手术入路、手术时间、术中出血量及各阶段髋关节功能Harris评分,分析术后骨折愈合及并发症情况。结果35例股骨头骨折患者获随访(23.49±8.72)个月。24例采用Kocher-Langenbeck 入路,手术时间(227.50±100.15)min,术中出血量(470.63±108.80)ml;10 例采用 Smith-Petersen 入路,手术时间(182.00±56.58)min,术中出血量(358.00±36.30)ml;1例采用改良髂腹股沟入路,手术时间155min,术中出血量400 ml;Smith-Petersen入路手术时间和术中出血量均小于Kocher-Langenbeck入路(P<0.05)。术后34例骨折愈合(8例并发异位骨化,6例并发浅部感染),1例并发股骨头缺血性坏死,最终行髋关节置换。髋关节功能Harris评分术前为(41.74±5.08),术后6个月为(78.17±6.16),末次随访时为(88.37±6.11),随时间的进展增加(F=624.7127,P=0.000)。末次随访时优良率为82.86%。结论股骨头骨折需综合骨折类型、合并损伤等因素,制定个性化治疗方案。PipkinⅠ型骨折推荐采用Smith-Petersen入路,Pipkin Ⅲ型骨折及Pipkin Ⅳ型髋臼后柱骨折推荐采用Kocher-Langenbeck入路,Pipkin Ⅳ型髋臼前柱骨折推荐采用改良髂腹股沟入路,合并Morel-Lavallée损伤时,推荐选择骨盆外架固定。第二部分 槲皮素促进成骨分化的机制研究目的探讨槲皮素对骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的影响,并探讨槲皮素对骨髓间充质干细胞(BMSCs)的调控机制是否与抗氧化及AMPK/SIRT1信号通路相关。方法采集小鼠BMSCs,用流式细胞仪检测mBMSCs表面标志物鉴定mBMSCs。mBMSCs分为对照组、槲皮素处理、槲皮素加通路抑制剂处理组。用槲皮素处理mBMSCs,测定细胞活力、乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH),采用qRT-PCR 及 Western blot 检测 SOD1 和 SOD2 mRNA 及蛋白水平,采用 Western blot 检测 mBMSCs 中 p-AMPK、AMPK 和 SIRT1 的水平,采用 qRT-PCR 方法检测mBMSCs中SIRT1的mRNA水平。用含槲皮素的成骨诱导培养基培养第3代mBMSCs,第7天定量检测mBMSCs的碱性磷酸酶活性,第14天茜素红S染色基质矿化并定量,qRT-PCR定量检测成骨细胞标志基因ALP、RUNX2、BMP2和SP7的mRNA水平。用含槲皮素的成脂诱导培养基培养mBMSCs,第14天油红O染色并定量,qRT-PCR定量检测脂肪细胞标志基因PPARG和FABP4的mRNA水平。用含槲皮素、AMPK抑制剂CC和SIRT1抑制剂Sirtinol的培养基培养原代mBMSCs 3天,检测mBMSCs中超氧化物歧化酶(SOD)活性,用 Western blot 检测 mBMSCs 中 p-AMPK、AMPK 和 SIRT1 的水平,用 qRT-PCR检测mBMSCs中SOD1和SOD2的mRNA水平。用含槲皮素、AMPK抑制剂CC和SIRT1抑制剂Sirtinol的成骨诱导培养基培养mBMSCs,第7天用qRT-PCR检测mBMSCs碱性磷酸酶mRNA表达水平,第14天用qRT-PCR检测成骨细胞晚期分化标志基因RUNX2、BMP2和SP7的mRNA水平。用含槲皮素、AMPK抑制剂CC和SIRT1抑制剂Sirtinol的成脂诱导培养基培养mBMSCs,第14天用qRT-PCR检测脂肪细胞标志基因PPARG和FABP4的mRNA水平。结果1.获得的 mBMSCs 表面 CD44、SCA-1、CD11b 和 CD45 阳性。2.与对照组比较,在0-100μM范围内,50和100μM的槲皮素对mBMSCs的活力和有氧呼吸均有明显的抑制作用(P<0.05),低浓度槲皮素(1、2、5和 10μM)显著促进 mBMSCs 增殖(1、2 和 10μM 组P<0.05,5μM组P<0.01),高浓度槲皮素(50和100μM)抑制mBMSCs增殖(50μM组第1、4天P<0.05,100μM 组第 1、4、7 天P<0.05)。3.与对照组比较,2和5μM槲皮素显著上调mBMSCs SOD的相对活性(P<0.01),2和5μM槲皮素显著上调SOD1和SOD2的mRNA水平(P<0.01),2和5μM槲皮素显著上调SOD1和SOD2的蛋白水平(2μM组SOD2P<0.05,2μM 组、5μM 组 SOD1 和 5μM 组 SOD2 P<0.01)。4.与对照组比较,2和5μM槲皮素显著上调mBMSCsp-AMPK和SIRT1蛋白水平(2μM组P<0.05,5μM组P<0.01),2和5μM槲皮素同样还上调SIRT1的 mRNA 水平(2μM 组 P<0.01,5μM 组P<0.001)。5.与对照组比较,2和5μM槲皮素显著上调mBMSCs成骨分化碱性磷酸酶活性(2μM组P<0.0μ5,5M组P<0.01),显著上调基质矿化水平(P<0.01),显著上调成骨细胞晚期分化标志基因ALP、RUNX2、BMP2和SP7 mRNA水平(5μM 组 ALP、RUNX2、BMP2、SP7 和 2μM 组 ALP、SP7 P<0.01,2μM 组RUNX2、BMP2P<0.05)。6.与对照组比较,2和5μM槲皮素显著下调mBMSCs成脂分化油红O染色面积百分比(2μM组P<0.01,5μM组P<0.001),显著下调脂肪细胞标志基因 PPARG 和 FABP4 的 mRNA 水平(5μM 组 PPARG、FABP4 和 2μM 组 FABP4 P<0.01,2μM 组 PPARGP<0.05)。7.与对照组比较,5μM槲皮素显著上调mBMSCs p-AMPK和SIRT1蛋白水平(P<0.01),与5μM组比较,Que+CC和Que+Sirtinol组显著下调mBMSCs p-AMPK和SIRT1蛋白水平(P<0.001);与对照组比较,5μM槲皮素显著上调SOD 活性以及 SOD1 和 SOD2mRNA 水平(P<0.001),与 5μM 组比较,Que+CC和Que+Sirtinol组显著下调SOD活性以及SOD1和SOD2mRNA水平(除Que+CC组P<0.05外,其余组P<0.01);与对照组比较,5μM槲皮素显著上调成骨细胞晚期分化标志基因ALP、RUNX2、BMP2和SP7 mRNA水平(P<0.01),下调脂肪细胞标志基因PPARG和FABP4 mRNA水平(P<0.01),与5μM组比较,Que+CC和Que+Sirtinol组显著下调成骨细胞晚期分化标志基因ALP、RUNX2、BMP2 和 SP7 mRNA 水平(Que+CC 组 SP7、Que+Sirtinol 组 SP7 和BMP2 P<0.01,Que+CC 组 ALP、RUNX2、BMP2 和 Que+ Sirtinol 组 ALP、RUNX2 P<0.05),上调脂肪细胞标志基因PPARG和FABP4mRNA水平(P<0.05)。结论槲皮素可能通过激活AMPK/SIRT1信号通路促进mBMSCs的成骨分化和抗氧化反应。