豌豆蚜对“抗”“感”苜蓿品种的生理适应机制研究

来源 :甘肃农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:sheryme
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豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)是苜蓿上的主要害虫,目前防治比较困难。为利于抗蚜苜蓿品种的选育,本论文通过对豌豆蚜在“甘农5号”紫花苜蓿(Medicago sativa L.‘Gannong No.5’)和“猎人河”紫花苜蓿(Medicago sativa L.‘Hunter river’)2个苜蓿品种上保护酶和解毒酶活性及其转录组解毒代谢相关基因的差异进行分析,探讨了豌豆蚜对不同苜蓿品种的抗氧化物及解毒适应机理;同时采用RNAi技术探究了豌豆蚜POD3和Car E4基因的功能,初步解析了豌豆蚜的解毒防御机理,取得如下主要研究结果:1.研究了豌豆蚜在“甘农5号”紫花苜蓿和“猎人河”紫花苜蓿上的存活以及保护酶和解毒酶的差异。结果发现,取食“甘农5号”紫花苜蓿的豌豆蚜在24 h时体内的超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、羧酸酯酶(Carboxylesterase,Car E)、谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathione-S-transferase,GST)、细胞色素P450s(Cytochrome P450s,P450s)活性最高,其死亡率从12 h的15.7%升到53.3%;取食“猎人河”紫花苜蓿的豌豆蚜其过氧化物酶(Peroxidase,POD),SOD,Car E活性呈现先上升后下降的趋势,过氧化氢酶(Catalase,CAT)活性呈现先下降后上升的趋势,死亡率从12 h的9.3%升到24 h的14.0%。从结果可以看出,“甘农5号”紫花苜蓿对豌豆蚜的影响大于“猎人河”紫花苜蓿,豌豆蚜为害2个苜蓿品种时均能诱导虫体内产生一系列生理酶活性的变化,相对于取食蚕豆的豌豆蚜,不同苜蓿品种更能引起豌豆蚜的应激反应。表明豌豆蚜在不同寄主或同一寄主不同品种间转换的生理适应性均存在显著差异。2.分析了豌豆蚜在“甘农5号”紫花苜蓿和“猎人河”紫花苜蓿上其体内解毒代谢酶基因的转录水平发生的差异。GO和KEGG分析表明,氨基酸代谢与合成、碳水化合物运输与代谢及解毒代谢方面有明显的富集。当取食这2个苜蓿品种时,豌豆蚜有1,695个基因(DEGs)差异表达,从中筛选出解毒代谢相关的差异基因有38个:羧酸酯酶7个、细胞色素P450s 16个、葡萄糖醛酸转移酶(Udp-Glucuronosyltransferases)3个、谷胱甘肽-S-转移酶3个、过氧化物酶6个,筛选出ABC转运蛋白(ATP-binding cassette transporter)差异基因3个,均上调,log2(Fold Change)值在1.25到2.47之间。即“抗”“感”苜蓿品种可以调控豌豆蚜体内相关的解毒代谢基因差异表达。3.构建了解毒代谢相关基因不同时间的表达模式以及探究了差异基因POD3、Car E4的功能。为了分析豌豆蚜在取食2个苜蓿品种后其体内解毒代谢相关基因的应答反应,本文利用实时荧光定量PCR技术检测了豌豆蚜从蚕豆转接到2个苜蓿品种后12、24、48和60 h时5 d龄若虫体内20个解毒代谢基因相对表达量的变化。结果分析发现,取食“甘农5号”紫花苜蓿的豌豆蚜体内Car E的6个基因和POD的3个基因在12 h均显著表达。取食“猎人河”紫花苜蓿的豌豆蚜体内Car E4和POD3在12 h和24 h表达极显著,到60 h表达下调,表达趋势为先上升后下降。结果说明豌豆蚜能通过调节解毒代谢通路适应苜蓿植株,其基因的表达量与其取食不同的苜蓿品种相关。利用RNAi技术对豌豆蚜的POD3和Car E4基因的功能进行了研究,结果表明,利用植物介导法递送2个目的基因的ds RNA均能有效沉默标靶基因的表达量,干扰效率为72.48%和51.01%。对干扰后的豌豆蚜进行敏感性测定试验,72 h后试虫表型出现差异,体色变淡,体型瘦小,行动迟缓且死亡率升高。其中介导ds Car E4和ds POD3的试虫死亡率升高,而介导ds GFP的试虫与介导清水的试虫死亡率无明显差异,排除了靶标基因自身参与调节豌豆蚜解毒代谢的可能。由此可见,基因Car E4和POD3参与豌豆蚜适应紫花苜蓿的过程。
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