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断奶仔猪腹泻和水肿病是两种导致断奶仔猪死亡的重要传染性疾病,对养猪业造成了巨大的经济损失。大肠杆菌F18菌株是引起这两种疾病的主要病原菌,从长远来看,从遗传角度上提高猪对大肠杆菌F18菌株的抗性,并结合免疫接种控制疾病是一种高效可行的方法。因此,找到能适用于中国地方猪种的F18大肠杆菌抗性功能基因和相关遗传标记具有十分重要的意义。杀菌通透性增加蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein, BPI)不但能够杀灭革兰氏阴性菌、中和内毒素或脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)的活性,还可以促进补体活化,增强吞噬的调理功能等一系列生物学活性,在动物机体的天然防御中起到了很重要的作用。本试验从群体、DNA、mRNA和蛋白水平分析了BPI基因对猪抗F18大肠杆菌感染的功能及机理,以期为今后利用其作为遗传标记开展猪抗病育种提供参考和依据。主要结果如下：1.采用PCR-RFLP方法对野猪和国内外10个猪群体BPI基因第10外显子Hpa II酶切位点遗传变异进行了检测,共检测到AA、BB和AB3种基因型,2个等位基因,其中野猪、藏猪、荣昌猪和淮猪群体中AA基因型为优势基因型,A等位基因为优势等位基因；外来商业化猪品种中,杜洛克群体AA基因型频率较高。序列分析表明AA基因型与GenBank中的序列一致,BB基因型存在A27G同义突变位点和T118G错义突变位点。基于BPI基因的等位基因频率构建11个猪群体的系统发生树,将11个猪群体分为两大类：第一类包括野猪、淮猪、藏猪、荣昌猪、杜洛克；第二类包括大白猪、长白猪、枫泾猪、梅山猪、二花脸、苏太猪。本研究结果显示猪群体间基于BPI基因在一般抗性上确实存在差异,这种差异与体型、生产类型等因素没有明显的联系。对BPI基因第10外显子Hpa II酶切位点3种基因型个体大肠杆菌F18菌株抗性／易感性进行分析,结果发现,AA基因型中大肠杆菌F18菌株抗性型个体的频率为90%,显著或极显著地高于AB基因型(57.1%)和BB基因型(17.4%)的个体,表明BPI基因第10外显子Hpa II酶切位点AA基因型对大肠杆菌F18菌株抗性是有利基因型。2.利用课题组前期建立的F18大肠杆菌病抗性和敏感性资源群体,筛选出性状基本-致的抗性型以及敏感型个体各8头,运用Real-time PCR方法研究在断奶仔猪中BPI基因mRNA的各个组织表达水平,并比较其在大肠杆菌F18菌株抗性和敏感性断奶仔猪个体间的差异表达情况；同时选取苏太猪不同日龄(8日龄、18日龄、30日龄和35日龄)仔猪各8头,不同品种(梅山猪、大白猪和苏太猪抗性群体)断奶仔猪各8头,分析BPI基因在初生到断奶不同发育时期以及在不同群体间的表达水平。结果表明,在对所有个体检测的11个组织中,BPI基因在心、肝、脾、肺、肾、胃、肌肉、胸腺、淋巴结中几乎不表达或表达量很低,但在十二指肠和空肠中表达量很高。在十二指肠和空肠中,BPI基因在抗性组的表达量均显著高于敏感组的表达量(P<0.05)。在8日龄,18日龄,30日龄和35日龄4个不同发育时期的苏太猪中,结果发现空肠和十二指肠在4个不同发育时期均高度表达。在空肠组织中35日龄表达量显著高于18日龄表达量(P<0.05),在8日龄、18日龄和30日龄之间表达量差异不显著(P>0.05)。十二指肠中35日龄表达量显著高于8日龄、18日龄和30日龄的表达量(P<0.05),8日龄、18日龄和30日龄之间表达量差异不显著(P>0.05)。梅山猪、大白猪和苏太猪抗性型群体之间BPI基因表达实验的结果显示,空肠和十二指肠在3个群体中都高度表达,且BPI基因在苏太猪抗性型群体中的表达量显著高于大白猪和梅山猪的表达量(P<0.05)。综上可见,BPI基因对抗断奶仔猪肠道中大肠杆菌F18菌株的感染可能具有直接作用,并且个体对大肠杆菌F18菌株的抗性可能与BPI基因在肠道中表达量上调有关。3.分析BPI基因第10外显子Hpa II酶切位点3种基因型在空肠和十二指肠中的表达水平。结果发现,AA基因型在空肠和十二指肠中的表达量要显著高于BB和AB基因型的表达量(P<0.05)。因此,进一步推测BPI基因AA基因型对抗大肠杆菌F18菌株引起的断奶仔猪腹泻与水肿病具有直接的作用,个体对大肠杆菌F18菌株的抗性与BPI基因在肠道中表达量上调有关。猪BPI基因外显子10Hpa II酶切位点AA基因型有望作为抗大肠杆菌F18菌株的遗传标记,用于抗大肠杆菌F18菌株等革兰氏阴性菌病的育种实践。4.苏太猪中BPI基因外显子10Hpa Ⅱ酶切位点多态性与部分免疫指标关联分析结果发现,AA基因型个体IL-12水平显著低于AB基因型个体(P<0.05),也低于BB基因型个体,但是差异不显著(P>0.05),其他细胞因子的水平在3种基因型间差异不显著(P>0.05),初步推断AA基因型个体可能具有较强的免疫应答能力,至少对于一般抗病力没有不利影响,利用其作为抗大肠杆菌F18的分子标记进行抗病育种具有可行性。5.为了在体外研究BPI蛋白表达情况及其抑菌功能,本研究成功构建了酵母表达载体、原核表达载体和哺乳动物表达载体。通过对表达条件的优化,酵母表达载体和原核表达载体均未能在表达菌株中检测到重组蛋白的表达,这可能是由于BPI蛋白强烈的抑菌作用造成的。最终在293-6E细胞培养上清中检测到BPI重组蛋白的表达,并对BPI重组蛋白进行生物信息学分析,发现BPI的理化性质、蛋白的二级和三级结构都和预定结果一致。此外,还发现猪BPl分子可能是由胞外区(35-485aa)、跨膜区(12-34aa)和胞内区(1-11aa)3部分组成。BPI属于分泌蛋白,主要在线粒体(44.4%),高尔基体(22.2%)中发挥生物学作用。这些分析和结论,为下一步BPI功能分析和抑菌实验的研究奠定了基础。