日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)是一种经蚊虫传播的黄病毒,能引起中枢神经系统损伤和猪的繁殖障碍,具有重要的公共卫生学意义。肿瘤抑制因子p53具有参与细胞周期捕获、细胞代谢、诱导细胞凋亡和先天性免疫的作用。与野生型小鼠相比,JEV感染p53缺失小鼠能引起较高病毒血症、死亡率,脑组织出现更为严重的炎症反应和病理变化。表明p53在宿主抗JEV感染中具有重要作用。除了已报道的p53增强I-IFN介导的抗病毒先天性免疫和诱导细胞凋亡外,是否还存在其他抗病毒先天性免疫调控机制?为了进一步阐明p53抗JEV的分子机制及深入理解p53介导的细胞与JEV相互作用,遂进行了本课题研究。JEV感染小鼠脑组织表达谱芯片发现,JEV感染的小鼠脑组织中IFITM3 mRNA水平显著上调,p53WT小鼠IFITM3 mRNA水平高于p53KO小鼠。这种变化与p53转录调控的靶基因IRF9、TLR3和GBP1等具有相似性,提示两者间存在某种联系。p53生物学功能的发挥多依赖于其转录活性,然而,在分析p53不同状态下,IFITM3 mRNA水平变化时,发现IFITM3的转录并不受p53的影响,说明两者并没有直接关系。但当对IFITM3蛋白表达变化进行检测时,发现IFITM3的蛋白丰度随p53信号通路的激活而明显上升,表明p53间接上调IFITM3的蛋白表达。考虑到蛋白棕榈酰化修饰对蛋白定位、稳定性、生物学功能的重要作用,对p53上调IFITM3蛋白丰度与蛋白棕榈酰化修饰的关系进行了评估,发现棕榈酰化抑制剂2-BP处理废除了p53与IFITM3间的调控关系。IFITM3棕榈酰化修饰的抑制后其蛋白表达明显下降,而转录水平未受影响。进一步探究证明2-BP处理后,IFITM3蛋白稳定性明显下降,半衰期由5h衰减为2h,溶酶体途径抑制剂Leupeptin处理能明显恢复IFITM3蛋白含量,并延长其半衰期至10h,说明IFITM3降解的主要途径为溶酶体途径。IFIITM3棕榈酰化修饰能增强IFITM3蛋白稳定性,抑制其在溶酶体中降解,也证实了p53可以间接调控IFITM3棕榈酰化修饰并增强其蛋白稳定性。蛋白棕榈酰化修饰受DHHC蛋白和PPT的可逆调节,因此,我们假设p53直接转录调控负责IFITM3棕榈酰化修饰的某些酶,如正向调控具有蛋白乙酰转移酶活性的DHHC家族成员(负责蛋白棕榈酰化修饰),或负调控乙酰蛋白硫酯酶APTs和蛋白棕榈酸硫酯酶PPTs(负责蛋白去棕榈酰化修饰),从而间接调节IFITM3的蛋白稳定性。随后对p53转录调控ZDHHC和PPT家族成员的能力进行了分析,发现在不同细胞系中ZDHHC1 mRNA水平均随p53状态而改变。对ZDHHC1蛋白水平检测也证实p53同样可以上调IFITM3的蛋白水平,从而说明了p53转录调控IFITM3表达。IFITM3蛋白棕榈酰化修饰利于其蛋白稳定性,ZDHHC1若修饰IFITM3,其蛋白表达和稳定性也会增加。ZDHHC1过表达上调IFITM3蛋白表达,并不影响其转录水平;ZDHHC1knockdown降低了IFITM3的蛋白丰度,说明了p53调控的中间分子ZDHHC1的确利于IFITM3蛋白表达与稳定性。进一步试验确认了ZDHHC1和IFITM3的表达变化与p53的蛋白表达变化存在一致性,证实了p53-ZDHHC1-IFITM3调控通路的存在。为阐明p53-ZDHHC1-IFITM3通路在JEV复制过程中的作用,分别对各个分子单独或协同作用于JEV复制的影响进行了分析。证实了p53通过转录调控ZDHHC1表达间接增强IFITM3蛋白稳定性,从而抑制JEV复制的作用。另外,JEV也存在拮抗p53抗病毒先天性免疫的机制,NS4A蛋白可将p53扣留在细胞浆中,抑制p53入核和转录活性的发挥,并利于JEV的复制。本研究证实了p53-ZDHHC1-IFITM3调控通路的存在,并阐明了抑制JEV复制的生物学作用,揭示了p53抗JEV复制的新的分子机制,也说明了p53参与抗病毒先天性免疫的多样性与灵活性。p53调控ZDHHC1的表达,将p53与蛋白棕榈酰化修饰联系起来,拓展了p53的生物学作用。p53-ZDHHC1-IFITM3通路的发现为进一步研究p53抗病毒的分子机制及开发抗病毒药物提供了一定参考依据。