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第一部分胃癌组织中Krüppel-like factor 4与β-catenin的表达 目的：探讨KLF4与β-catenin mRNA和蛋白的表达变化对胃癌发生、发展的价值及二者间可能的相关性，也为下一步研究奠定基础。 方法：采用免疫组织化学法检测84例胃癌组织和配对癌旁组织中KLF4与β-catenin蛋白的表达情况；分别用RT-PCR，Western blotting检测84例胃癌组织中KLF4与β-catenin mRNA和蛋白表达水平，进一步验证免疫组织化学结果。用免疫沉淀明确KLF4和β-catenin两种蛋白在胃癌中是否发生相互作用。 结果：胃癌组织中KLF4蛋白表达降低，其阳性表达率为8.3％(7/84)，明显低于在癌旁组织中的表达率81％(68/84)，二者间差异有统计学意义(P<0.01)。胃癌组织中β-catenin蛋白表达升高，其阳性表达率为76.2％(64/84)，明显高于配对癌旁组织中的表达率15.48％(13/84)，二者间差异有统计学意义(P<0.05)。统计学分析表明：KLF4与胃癌临床分期、肿瘤浸润深度、分化程度相关，β-catenin则与胃癌的淋巴结转移密切相关；KLF4与β-catenin蛋白在胃癌组织中表达成负性相关(rs=-0.672，P<0.05)。与配对癌旁组织相比，胃癌组织中KLF4 mRNA表达降低，两者间差异具有统计学意义(P<0.05)；而β-catenin mRNA表达则明显升高，两者间差异具有统计学意义(P<0.05)。用Western blotting检测胃癌标本中KLF4和β-catenin蛋白表达结果显示：胃癌标本中KLF4蛋白表达明显降低，与配对癌旁组织间的差异具有统计学意义(P<0.05)；而β-catenin蛋白表达明显升高，与配对癌旁组织间的差异具有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR，Western blotting检测结果与免疫组织化学结果一致。免疫沉淀结果证实：用羊抗人KLF4多克隆抗体能够从胃癌标本中沉淀下β-catenin蛋白，用兔抗人β-catenin单克隆抗体也能从胃癌组织中沉淀到KLF4蛋白。 结论：胃癌中KLF4表达明显降低而β-catenin表达则升高，它们的表达趋势成负性相关。KLF4与β-catenin在胃癌组织中存在相互作用。 第二部分人KLF4基因过表达慢病毒载体构建及验证 目的：构建KLF4基因过表达慢病毒载体，明确外源性KLF4基因对体内外胃癌细胞恶性生物学行为的影响及作用机制。 方法：用真核表达质粒pcDNA3.1IE-KLF4-EGFP将外源性KLF4基因导入慢病毒载体pLv-UbC-IRES2-EGFP中，构建pLv-KLF4-IRES2-EGFP重组慢病毒表达载体。酶切和测序鉴定后的重组质粒转染至胃癌细胞中，观察转染情况，RT-PCR检测KLF4 mRNA表达变化。慢病毒包装转染同样的胃癌细胞，荧光显微镜观察细胞转染率，Western blotting检测KLF4蛋白。 结果：重组质粒经酶切和DNA测序证实目的基因插入正确；pcDNA3.1IE-KLF4-EGFP转染胃癌细胞后KLF4 mRNA表达升高。慢病毒包装后转染胃癌细胞株后荧光显微镜观察到绿色荧光染色的细胞，转染有效率达95％以上，Western blotting检测到目的蛋白KLF4，与理论值相吻合。 结论：“三质粒载体”法是构建慢病毒载体的有效方法，通过DNA测序和转染胃癌细胞后检测mRNA及蛋白表达证实KLF4基因过表达慢病毒载体构建成功。 第三部分 KLF4负性调节β-catenin表达从而抑制胃癌细胞的恶性生物学行为 目的：探讨KLF4基因过表达后胃癌细胞中β-catenin表达变化，明确二者间的相互作用以及它们发生作用后对体内外胃癌细胞恶性生物学的影响。 方法：本部分实验分为三组，即KLF4基因过表达组(实验组)、慢病毒空载体转染组、亲代胃癌细胞组。采用Real-Time PCR、Western blotting检测各组胃癌细胞中β-catenin表达变化；流式细胞术检测胃癌细胞的周期和增殖水平的改变；Virestern blotting检测Bcl-2、Bax、β-catenin、KLF4及E-cadherin蛋白表达情况；Transwell小室分析胃癌细胞45-KLF4及MKN-45侵袭和转移能力的变化；建立裸鼠体内移植瘤模型对体外实验结果进一步验证，用HE验证移植瘤、免疫组织化学和Western blotting检测移植瘤中KLF4、β-catenin、Bcl-2、Bax及E-cadherin蛋白表达情况。 结果：与亲代胃癌细胞相比较，KLF4慢病毒空载体转染的胃癌细胞中KLF4和β-catenin mRNA表达变化无统计学差异，因此在接下来的实验中不再用空病毒载体组作为对照。与亲代胃癌细胞组相比较，实验组的胃癌细胞中β-catenin mRNA及蛋白表达量均明显下降(P<0.05)。与MKN-45细胞相比较，45-KLF4细胞增殖周期明显减慢，G1/S值增高(P<0.05)；细胞凋亡增加(P<0.05)；细胞的侵袭和转移能力降低(P<0.05)；细胞平板克隆形成能力减弱，(P<0.05)。与MKN-45细胞相比较，胃癌细胞45-KLF4在裸鼠体内的生长速度明显减慢、体积较小；接种21天后测量，45-KLF4组移植瘤体积为(464.4±12.5)mm3，MKN-45组移植瘤体积为(1161.0±41.5)mm3，二者相比差异具有统计学意义(P<0.05)；45-KLF4组移植瘤与MKN-45组移植瘤重量分别为(348.46±50.76)mg、(924.0±151.78)mg，二者相比差异具有统计学意义(P<0.05)；免疫组织化学和Western blotting检测移植瘤中Bcl-2、Bax、β-catenin、KLF4及E-cadherin蛋白表达结果显示：与MKN-45组移植瘤相比较，45-KLF4细胞组中Bcl-2蛋白表达降低，Bax蛋白表达升高，β-catenin蛋白表达降低，E-cadherin蛋白表达升高，它们间的表达变化与对照组间的差异具有统计学意义(P<0.05)。 结论：KLF4基因在胃癌中发挥抑癌基因的功能，具体机制可能是负性调节β-catenin的表达而发挥作用；KLF4减慢胃癌细胞增殖可能是通过降低增殖基因Bcl-2表达、增加细胞凋亡可能是通过诱导促凋亡基因Bax表达，KLF4减少肿瘤细胞的侵袭和转移可能是通过上调E-cadherin表达实现的。