论文部分内容阅读
葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)在肌肉细胞和脂肪细胞的葡萄糖摄取过程中起着重要作用。有研究表明,GLUT4响应胰岛素刺激向细胞膜募集,促进细胞对葡萄糖的摄取。这一过程的失调与Ⅱ型糖尿病相关。研究活细胞内GLUT4囊泡的转运过程,可以进一步加深对Ⅱ型糖尿病发病机理的研究,并寻找更有效的治疗手段。由于三维单微粒定位技术的局限性以及所使用的荧光标记物易于漂白且荧光强度相对较弱的缺陷,目前对GLUT4胞内转运机制的研究仅局限于观察GLUT4囊泡在细胞内转运的某些短时程或者局部区域的片段。在三维空间内对GLUT4进行长时程的实时定位,能够为研究活细胞内GLUT4的转运过程提供新的证据。本文的目的就是研究和开发一种活细胞内GLUT4囊泡纳米级三维实时定位技术,为我们研究活细胞内GLUT4转运提供新的手段。本文利用量子点(QDs)标记活细胞内的GLUT4。由于QDs具有激发光谱宽、发射光谱窄、荧光亮度高以及耐光漂白等优点,所以标记了QDs的GLUT4克服了传统荧光标记物荧光图像信噪比低及不能够进行长时程成像观察的缺点。同时,利用荧光点离焦图像与离焦距离的关系,可以设计单微粒纳米级三维实时定位算法,构建单微粒纳米级三维实时定位系统。本文主要内容如下：(1)研究QDs标记活细胞内GLUT4的实验方法。通过一系列实验,我们利用调节反应温度和试剂浓度的方法,标记了活细胞表面的GLUT4,并观察GLUT4在活细胞撤去胰岛素刺激的状态下胞吞进入特定细胞器的过程。通过实验证明利用QDs标记活细胞内GLUT4的实验方法具有特异性强、灵敏度高、光毒性小且容易被检测的优点。(2)设计单微粒纳米级三维实时定位算法。通过实验和计算,推导出实验室所用荧光显微成像系统中荧光点离焦图像最外层圆环半径与离焦距离的关系,并进步推导出利用离焦图像最外层圆环半径计算离焦距离的公式。继而为实现单微粒纳米级三维实时定位设计图像处理算法,包括荧光图像的预处理算法、通过迭代的质心算法计算荧光点X-Y平面上的位置以及测量离焦图像最外层圆环半径以计算荧光点离焦距离的算法。(3)研究并开发单微粒纳米级实时定位系统。为将单微粒纳米级三维实时定位算法应用到实验中,我们设计了一套单微粒纳米级实时定位系统。该系统包括硬件和软件部分。硬件部分主要由本实验室自主研发的仪器结合倒置显微镜和CCD组成。软件部分包含对系统硬件部分各单元的控制,并结合了单微粒纳米级三维实时定位算法。