论文部分内容阅读
新型H7N9流感病毒自2013年在我国出现以来,给家禽生产和公共卫生均造成了极大危害。其中,2016～2017年人群中的第五波流行期内,更是出现了 HA裂解位点处携带多碱性氨基酸的变异株,使得H7N9从对家禽低致病性（Lowpathogenic,LP）进化为高致病性（Highly pathogenic,HP）,并一度出现LP和HPH7N9共存的复杂局面。随着H5/H7二价疫苗在家禽中的推广使用,H7N9在禽、人中的分离率均显著降低,有效遏制了 H7N9病毒的进一步扩散流行。目前,LPH7N9已鲜有分离,仅HPH7N9偶有散发。然而,对H7N9病毒的持续监测及其变异规律的研究仍至关重要。NA作为A型流感病毒（Influenza A virus,IAV）囊膜表面表达丰度仅次于HA的糖蛋白,是一种复杂的多功能蛋白,在帮助病毒脱离黏蛋白相关的诱饵受体、促进病毒从感染细胞中释放等过程中具有关键性作用。其中,NA发挥神经氨酸酶功能与宿主细胞表面受体的相互作用被认为是决定IAV感染性和传播能力的重要因素。此外,NA上还存在第二受体结合位点（Second receptor binding site,SRBS）,可通过保持底物与该位点密切接触来增强附近酶催化位点的活性,并以这种方式促进病毒颗粒的HA-NA平衡,影响病毒复制及致病能力。因此,研究H7N9亚型流感病毒NA基因的适应性氨基酸位点变异及其对病毒神经氨酸酶功能、受体结合特性和致病性的影响,对探究H7N9的进化规律并掌握其流行趋势十分必要。1.分析H7N9亚型禽流感病毒NA基因适应性变异的氨基酸位点通过全球流感共享数据库（Global Initiative on Sharing All Influenza Data,GISAID）检索下载自2013年以来禽源、人源H7N9亚型流感病毒的NA基因序列,获得人源序列1467条,禽源序列1039条。利用生物信息学方法,分别纵向比对人、禽源各年份序列,并横向比对相同年份的人、禽源序列,筛选存在适应性变异的氨基酸位点。重点关注位于神经氨酸酶催化位点和SRBS等功能区附近的位点变异。结果显示,A21T（按N9 计）、M72I/T、E73G/K、D121N、R126K、Y166H、T178A、V209Y/I、S242P、D354N、D431G这11个位点在禽源和人源H7N9病毒的NA上均呈现随年代递进的明显规律性变异。其中,D121N、R126K、S242P位于酶催化位点附近;Y166H在禽源和人源序列中的变异稳定且程度逐渐变大;T178A、V209Y/I位于骨架残基附近;D354N、D431G位于SRBS附近,且D354N可能对N-糖基化的状态造成影响,D431G紧邻SRBS的K432位点。2.H7N9亚型NA点突变重组病毒的拯救及病毒神经氨酸酶功能测定为了明确第一章筛选出的NA适应性位点变异对H7N9病毒神经氨酸酶功能的影响,选取其中的Y166H、S242P、D354N、D431G共4个位点,分别在A/chicken/Guangdong/GD15/2016 的 HP 病毒骨架 rGD15 及其 HA 基因人为缺失“KRTA”基序的LP病毒骨架△ rGD15上进行NA基因的定点突变,构建并拯救了一系列点突变H7N9重组病毒。进一步对上述救获的8株重组病毒及其母本病毒进行了不同细胞上的生长曲线和神经氨酸酶功能测定。由病毒复制动力曲线发现,rGD15-D431G在MDCK细胞上的生长状况较差,而rGD15-P242S在MDCK上的生长状况优于母本毒rGD15,LP骨架上趋势一致。在人源细胞A549上,72 h出现明显差异,rGD15-P242S的繁殖滴度显著高于母本病毒,而rGD15-H166Y、rGD15-D354N、rGD15-D431G的复制性能不及母本病毒。在禽源细胞CEF上,HP和LP骨架上的D431G突变均造成了比母本病毒更低的复制水平。神经氨酸酶活性试验显示,无论是HP还是LP病毒骨架,D431G突变病毒的酶活性均相对最低,P242S突变病毒的酶活性均相对最高。红细胞的释放试验也表明,D431G突变在HP和LP病毒骨架上均导致了相对最慢的红细胞释放速度,这与酶活性结果一致。3.NA点突变H7N9亚型重组病毒的受体结合特性、小鼠致病性首先利用固相直接结合ELISA试验探究H7N9点突变重组病毒的受体结合特性。结果显示,HP骨架上的4株点突变重组病毒的受体特性与rGD15相同,仍为双受体结合特性。接着测定在HP H7N9模式病毒上NA蛋白适应性氨基酸位点的变异对小鼠致病力的影响。结果显示,rGD15-P242S引起小鼠体重下降更明显,其在肺脏的复制能力也更强,其他病毒引起体重减轻的能力均与rGD15相似或弱于rGD15。攻毒3dpi、5dpi后肺脏中rGD15-D431G的滴度均显著低于rGD15,5dpi时脾脏中也出现同样趋势。在肾脏中,各病毒复制效率基本相似。通过对攻毒后细胞因子的检测发现,rGD15-P242S刺激宿主产生炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β的应答水平显著高于rGD15,rGD15-D431G刺激宿主产生TNF-α、IL-1β、INF-γ的水平显著低于rGD15。综上所述,本研究以HP H7N9亚型禽流感病毒及其致弱病毒为骨架,测定并分析了 NA基因适应性氨基酸位点变异对神经氨酸酶功能、受体结合特性和小鼠致病性的影响。研究结果可一定程度推进对H7N9病毒进化与变异规律的理解。