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本研究以我国重要海水经济养殖鱼类牙鲆(Paralichthys olivaceus)为实验材料,利用mRNA差异显示技术(mRNA differential display,DD)研究了鳗弧菌感染前后差异基因的表达,通过RACE(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆得到了两个差异片段的全长cDNA,利用生物软件对基因的生物信息学进行了预测分析,并借助于半定量RT-PCR技术对基因的时空表达进行了较为详细的研究,现将主要的研究结果分述如下:1. DD-PCR分离鳗弧菌感染前后差异表达的牙鲆cDNA采用DD-PCR对鳗弧菌感染前后差异基因的表达进行了研究,共得到20个感染前后在牙鲆肝脏、肾脏和脾脏中差异表达的cDNA片段。通过对差异片段的回收、再扩增、克隆、测序、序列比对以及验证分析后,最终得到9个阳性片段,其中两个片段与已知基因高度同源:一个与牙鲆C3补体(Complement component 3)同源;另一个与牙鲆TEGT(testis-enhanced gene transcript)基因同源。其余7个为新的cDNA片段。半定量RT-PCR结果表明,在检测的7种组织中,C3补体只在对照组的肝脏中微量表达,注射鳗弧菌6h后在小肠中开始了表达,而且随着时间的延长,在肝脏和小肠中的表达量呈逐渐增加的趋势,推测C3补体在牙鲆鳗弧菌中起着重要的免疫调节作用。组织表达分析表明,TEGT基因在所检测的对照组7个组织中均为组成型表达,鳗弧菌感染后的6h,在各个组织中的表达量均增加,其中脾脏增加的最明显,是对照组的2倍,此后TEGT基因在脾脏中的表达随时间延长而呈下降的趋势;注射后的24h时,TEGT基因在肝脏和肾脏中的表达量达到最大,此后也随时间延长而呈下降的趋势。这说明TEGT基因存在组成型和诱导型两种表达机制,在防御病原菌的侵染过程中可能发挥着重要的作用。2.牙鲆IL-1RII基因全长cDNA的克隆及分析通过DD-PCR和RACE技术克隆得到了牙鲆白介素1受体类型II(IL-1RII)基因的全长cDNA。序列全长1793bp,包括一个100bp的5’末端非翻译区(Untranslated region,UTR)、430bp的3’UTR和长度为1263bp的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)。其中在3’UTR区还发现了3个重复的AU (ATTTA)序列。其ORF编码的蛋白含有420个氨基酸,其中含有一个16个氨基组成的信号肽,该蛋白预测的分子量为46.65KD,等电点为7.19。生物软件分析表明,该蛋白具有IL-R家族的典型结构特征:含有两个Ig样的结构和一个跨膜区;二级结构分析表明它属于混合型蛋白,空间结构和人IL-1RI晶体结构模型非常相似。通过和真鲷等鱼类以及鼠、人等哺乳动物IL-1RII基因的序列比对,发现了3个脯氨酸残基的保守位点(第155、263、268位);同源性分析表明该序列和真鲷、虹鳟的相似性比较高,分别为60.0%和47.4%,在构建的系统进化树中首先聚在了一起,然后再和小鼠、猴、人等哺乳动物聚集在一起。半定量RT-PCR检测表明,IL-1RII在正常牙鲆的大多数组织中均表达,注射鳗弧菌6小时后在肾脏和脾脏的表达量显著增加,分别是对照组的1.9倍和2.0倍。初步分析表明它具有信号转导功能,在防御细菌侵染的过程中发挥重要的免疫调节作用。3.牙鲆TM4SF4基因全长cDNA的克隆及分析借助于DD-PCR和RACE克隆得到了牙鲆四跨膜超家族成员4(TM4SF4)基因的全长cDNA。该cDNA全长1257bp,其中5’UTR为174bp,3’UTR为489bp,ORF为594bp,可编码197个氨基酸,蛋白质预测的分子量约为20.58KD,等电点为4.48。它具有四个疏水性跨膜区和三个保守的CCG(Cys-Cys-Gly)骨架等TM4家族的典型特征结构,同时还发现一段27个氨基酸组成的序列(53GSGVLMIFPALVFL GLKNNDCCGCCGN79)在所比较的9个物种中高度保守。同源性分析表明该基因的蛋白序列与鱼类以及哺乳动物类具有高度的相似性,与河豚的同源性最高为80.2%,与斑马鱼、爪蟾、鼠、猴、人、狗、牛的同源性分别为:68.5%、64.5%、68.0%、65.5%,66.5%、66.5%、66.5%。组织表达分析表明,牙鲆TM4SF4基因在对照组的脾脏和肾脏中都只有极其微弱的表达,但鳗弧菌感染以后的6h在脾脏中的表达量急剧增加,达到对照组的5.2倍,注射后的24h在肾脏中的表达量也急剧增加,是对照组的4.2倍;同时基因在肝脏中的表达呈现出随注射后时间的延长表达量逐渐增加的趋势,所以该基因表现出了明显的诱导型表达的特点,它可能也在牙鲆抵抗病原菌侵染的过程中发挥重要的免疫调节作用。