短小蛇根草（Ophiorrhiza pumila）为多年生草本植物,其次生代谢产物喜树碱（Camptothecin,CPT）是一种具有细胞毒性的喹啉类生物碱,对DNA拓扑异构酶I具有很好的抑制作用,是一类具有独特抗癌机制的植物药。色氨酸脱羧酶（Tryptophan decarboxylase,TDC,EC 4.1.1.28）是喜树碱合成路径中连接初生代谢和次生代谢的关键酶,可以催化色氨酸脱羧生成色胺,其活性直接影响着喜树碱的生物合成及相关代谢过程。本研究是在本实验室前期建立的短小蛇根草转录组数据库的基础上,以短小蛇根草无菌苗为研究材料,运用分子生物学的手段,分离得到一条新的色氨酸脱羧酶基因并命名为TDC2,基于此对其进行序列比对分析,原核表达、蛋白纯化以及酶学性质等生物催化研究。论文的主要研究结果如下:1、TDC2基因克隆与序列分析以短小蛇根草无菌苗为研究对象,提取其全部组织RNA并逆转录合成c DNA。基于转录组数据库中的序列设计上下游引物,以c DNA为模板,对目的基因进行PCR扩增,克隆得到短小蛇根草色氨酸脱羧酶基因TDC2。结果显示该序列长1536 bp,不含内含子,编码511个氨基酸;系统发育树分析表明其与美丽帽柱木（Mitragyna speciose）和长春花（Catharanthus roseus）等植物来源的色氨酸脱羧酶亲缘关系更接近;该基因编码色氨酸脱羧酶TDC2蛋白分子量为57.01k Da,理论等电点大小为6.39,属于不稳定的疏水性蛋白;在高尔基体、细胞质、液泡、细胞核以及线粒体等多种细胞器以及分泌系统的囊泡中均有分布,其中在细胞质中高达52.2%,分布最多;软件预测该蛋白有4个可能的磷酸化位点、没有信号肽且不含跨膜结构;二级结构分析显示该蛋白有22个а螺旋,有10个β折叠,β折叠由33个无规则卷曲连接。2、TDC2基因的组织特异性表达为了解析短小蛇根草中色氨酸脱羧酶基因TDC2的空间表达特征,本研究以短小蛇根草肌动蛋白基因（Actin）为内参基因,应用Real-time PCR技术对短小蛇根草无菌苗的根、茎和叶中TDC2基因相对表达量进行分析。结果表明TDC2基因在短小蛇根草根中的表达量显著高于在茎和叶,这与喜树碱主要在短小蛇根草的根部分布的特征一致,这一结果证明短小蛇根草中色氨酸脱羧酶TDC2基因可能参与了喜树碱的生物合成。3、重组蛋白TDC2的表达条件优化通过双酶切反应以及一步克隆重组分别将色氨酸脱羧酶基因TDC2构建到原核表达载体p ET28a和p Cold TF上。将鉴定后的重组质粒p ET28a-TDC2和p Cold TF-TDC2分别转入蛋白表达菌株BL21（DE3）中进行原核表达。研究结果表明,重组蛋白p Cold TF-TDC2在细胞内主要以可溶性蛋白形式存在,而重组蛋白p ET28a-TDC2在细胞内主要以包涵体形式存在。两者在相对分子质量约115 k Da处均可以检测到1条特异性蛋白条带,即为表达出的重组蛋白TDC2。对可溶性表达目的蛋白的p Cold TF-TDC2菌株进行培养条件优化,最优的表达条件为:培养菌种到对数中后期(3h,OD₆₀₀=0.8-1.0)后,加入0.05mmol·L^-1异丙基硫代β-D-半乳糖苷（Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG）,最后将其置于20℃、220r的条件下诱导培养24h。4、重组蛋白TDC2的纯化及其酶学性质研究将最优表达条件下诱导培养所得的菌体进行富集,用PBS洗涤、悬浮,超声破碎,利用Ni-NTA亲和层析纯化得到浓度为0.25 mg·m L^-1的目标蛋白。为了研究该目标蛋白的酶学性质,将重组蛋白TDC2进行体外生物催化反应。相关酶学性质具体为:最大反应速度V_max的数值为0.20 umol·min^-1,米氏常数K_m的数值为1.08 mmol·L^-1,转换数k_cat的数值为0.78 S^-1,k_cat/K_m的比值为774.5 S^-1·mol^-1。最适反应p H为8.0,最适反应温度为45℃,最适反应辅因子浓度为0.1mmol·L^-1,在10mmol·L^-1浓度Mn²⁺的作用下,色氨酸脱羧酶TDC2催化活力略有提高,然而在10mmol·L^-1浓度金属离子Zn²⁺,Fe²⁺以及Cu²⁺对重组蛋白TDC2的生物催化反应却有着很强的抑制作用。