抑郁症是一种复杂的心境及情感障碍类疾病,又被称之为抑郁障碍,其主要临床表现为显著而持久的心境低落、兴趣缺失、主动性缺乏等。据WHO调查显示,自2004年起,抑郁症已成为人类第三大顽症,预计至2030年抑郁症将成为影响人类生活的第一大疾病。目前,临床常用的抗抑郁药大多存在抗抑郁谱窄、起效慢、不良反应大和易复发等缺陷。据报道,仍有三分之一的抑郁症患者对目前的抗抑郁药物治疗无效,提示我们对抗抑郁药物的研发及抗抑郁的作用机制的认识需要进一步加深,为临床抗抑郁治疗提供更多的科学线索。抑郁症病因复杂,涉及多种发病机制主要包括单胺类神经递质假说、下丘脑-垂体-肾上腺皮质(HPA)轴亢进假说、脑内神经营养因子假说、氧化应激假说等。在过去的几十年里,单胺类神经递质假说作为抑郁症发病机制的主要病理假说,得到了广泛关注,已成为目前临床抗抑郁药的主要靶点。大量临床证据和基础实验表明,神经炎症在抑郁症病理进程中发挥着不可忽视的作用。中枢神经系统炎症过程可能通过影响神经递质及神经营养平衡等多个途径影响抑郁症的发病。细胞因子和炎症介质可以通过细胞表面受体作用于星形胶质细胞,调节行为和突触功能。神经炎症也能够激活兴奋性通路,诱导细胞凋亡及大脑区域(如海马和前额叶皮层)神经元减少。这些研究提示,抑制神经炎症可能会发挥抗抑郁作用。研究报道许多传统中药具有显著的抗抑郁临床疗效。因而,从传统中草药或者天然药物中发现并开发抗抑郁制剂有望成为抑郁症药物治疗的突破方向之一。益母草碱是中药益母草中的一种有效生物碱。益母草属中药唇形科益母草属(Leonurus)植物,始载于《神农本草经》,其主要功效是活血、调经、祛瘀、消水,善治经产诸证,具有“血脉圣药”之称。有研究报道,益母草能够减轻孕期妇女的焦虑症。益母草碱(Leonurine)作为其有效生物碱,又名SCM-198。现代药理研究已证实益母草碱具有兴奋子宫、溶栓、抗凝、降血黏度、降脂、降低红细胞聚集、抑制血小板聚集、改善微循环、抗氧自由基、抗炎、减轻细胞内钙超载等诸多作用。前期学者报道指出,益母草碱对动脉粥样硬化、糖尿病及心血管功能异常具有治疗作用,从而为拓宽其临床应用提供了药理学基础。近年来研究发现,益母草碱有许多异于传统适应症的药理作用如能够在脑缺血、帕金森病和阿尔茨海默等病中发挥中枢保护作用,显著改善模型动物的行为缺陷,促进神经元存活及抑制神经炎症。抑郁症作为发病率最高的神经精神疾病,与其他精神类疾病有诸多相似病理机制。然而,益母草碱的抗抑郁作用尚不清楚。本文通过建立慢性温和应激(Chronic mild stress,CMS)诱导的小鼠抑郁症模型,研究益母草碱的抗抑郁样作用及其作用机制。研究结果显示,给予益母草碱(60 mg/kg)治疗四周后,能够显著升高CMS模型小鼠的糖水偏爱率,缩短强迫游泳和悬尾实验的不动时间;改善CMS模型小鼠脑内单胺类和氨基酸类神经递质的异常;增加CMS模型小鼠海马星形胶质细胞的数量;增加CMS模型小鼠海马神经营养因子GDNF、BDNF水平;减轻海马神经元损伤。此外,益母草碱(60mg/kg)治疗四周后,能显著减少CMS模型小鼠海马炎性因子白介素(IL)-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α的蛋白水平,抑制NF-bκB信号通路激活。本研究发现益母草碱具有抗抑郁作用,其机制可能是抑制脑内神经炎症、改善脑内神经递质水平异常,为深化益母草碱的临床应用提供了学术基础。目的:应用C57BL/6J小鼠建立CMS抑郁模型,观察益母草碱对CMS模型小鼠的抗抑郁作用,阐明益母草碱抗抑郁作用的潜在机制。方法:本实验将雄性C57BL/6J小鼠(体重18-25 g)随机分为五组:正常对照组、CMS抑郁模型组、CMS+益母草碱(30mg/kg/day,i.g)治疗组、CMS+益母草碱(60 mg/kg/day,i.g)治疗组、CMS+氟西汀(20mg/kg/day,i.g)治疗组。每只单笼饲养,除正常对照组外,其余四组给予慢性温和应激,持续六周,此期间正常对照组常规饲养。通过糖水偏爱实验检测模型成功后,CMS +氟西汀治疗组和抑郁症模型+益母草碱治疗组小鼠灌胃:氟西汀(20mg/kg/day,i.g),益母草碱(30mg/kg/day 或 60mg/kg/day,i.g),同时正常对照组小鼠每天灌胃给予等量生理盐水配制的1%CMC-Na,连续给药四周。1.通过糖水偏爱试验(sucrose preference test,SPT)、强迫游泳试验(forced swimming test,FST)和悬尾试验(tailsuspensiontest,TST)评价益母草碱的抗抑郁作用;2.应用高效液相色谱法(High performance liquid chromatography,HPLC)检测益母草碱对 CMS 模型小鼠海马和前额叶皮层内单胺类神经递质去甲肾上腺素(NE)、5-羟色胺(5-HT)、多巴胺(DA)及其代谢产物5-羟吲哚乙酸(5-HIAA)、双羟基乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA);氨基酸类神经递质谷氨酸(Glutamate,Glu)、天冬氨酸(Aspartic acid,Asp)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid,GABA)、甘氨酸(Glycine,Gly)、牛磺酸(Taurine,Tau)、丝氨酸(serine,Ser)、谷氨酰胺(Glutamine,Gln)的影响;3.应用免疫荧光观察益母草碱对CMS模型小鼠海马星形胶质细胞的影响;4.应用采用尼氏染色、透射电镜技术及Tunel细胞凋亡检测方法观察益母草碱对CMS模型小鼠海马神经元保护作用;5.应用Western blot方法观察益母草碱对CMS模型小鼠海马脑源性神经营养因子BDNF、胶质源性神经生长因子(GDNF),炎性因子 IL-1β、TNF-α、IL-6,NF-kB(nuclearfactorkappaB)信号核转录因子P65、IKKβ的磷酸化水平的影响。结果:1.益母草碱改善CMS模型小鼠抑郁样行为小鼠CMS造模六周后,较于正常对照组,小鼠糖水偏爱率显著降低(P<0.01),强迫游泳及悬尾实验的不动时间显著增加(P<0.01)。与CMS抑郁模型组比较,给予益母草碱(60mg/kg)治疗四周后,糖水偏爱率显著升高(P<0.05),强迫游泳和悬尾实验中不动时间显著缩短(P<0.05)。表明益母草碱可显著改善CMS模型小鼠的抑郁样行为。2.益母草碱改善CMS模型小鼠脑内神经递质异常小鼠CMS造模六周后,较于正常对照组,小鼠海马与前额皮层5-HT、NE、DA的含量显著降低(P<0.05),海马5-HIAA及前额皮层HVA和DOPAC含量显著升高(P<0.05)。与CMS模型组比较,给予益母草碱(60mg/kg)治疗四周后,小鼠海马与前额皮层5-HT、NE、DA含量显著升高(P<0.05);前额皮层DOPAC含量显著减少(P<0.05)。此外,较于正常对照组,CMS模型小鼠海马脑区Asp浓度显著升高(P<0.01),GABA浓度显著降低(P<0.05);前额皮层Ser和Asp的浓度显著升高(P<0.05),Tau和Gln浓度显著降低(P<0.05)。给予益母草碱(60 mg/kg)治疗四周后,显著降低CMS模型小鼠海马Asp,前额皮层Ser水平(P<0.05),升高海马GABA及前额叶皮层Tau水平(P<0.05)。表明益母草碱可改善CMS模型小鼠脑内神经递质异常。3.益母草碱增加CMS模型小鼠海马星形胶质细胞数量免疫荧光结果显示,较于正常对照组,小鼠CMS造模六周后,海马星形胶质细胞GFAPP阳性细胞数显著减少(P<0.01),给予益母草碱(60mg/kg)治疗四周后,显著增加CMS模型小鼠海马星形胶质细胞GFAP阳性细胞数(P<0.05)。表明益母草碱对CMS模型小鼠海马星形胶质细胞具有保护作用。4.益母草碱增加CMS模型小鼠海马神经营养因子BDNF、GDNF的水平Western blot实验结果显示,与正常对照组比较,CMS模型组小鼠海马神经营养因子BDNF、GDNF的水平显著降低(P<0.01)。给予益母草碱(60 mg/kg)治疗四周后,显著升高CMS模型小鼠海马神经营养因子BDNF、GDNF的水平(P<0.05)。表明,益母草碱可改善CMS模型小鼠脑内神经营养水平。5.益母草碱减轻CMS模型小鼠海马神经损伤小鼠CMS造模六周后,海马齿状回(DG)颗粒细胞和CA3区锥体细胞排列疏松,细胞体积变小,核仁固缩,尼氏体减少;神经元发生明显凋亡且超微结构发生损伤,可见大量损伤的线粒体,此外,海马髓鞘变薄,g-ratio显著升高(P<0.01)。相较于CMS模型组,益母草碱(60mg/kg)治疗组小鼠海马DG区颗粒细胞和CA3区锥体细胞神经元排列、胞体大小、胞核形态及尼氏体数目均接近正常,神经元凋亡减轻,神经元超微结构及海马髓鞘形态改善。表明益母草碱可改善CMS模型小鼠海马神经损伤。6.益母草碱抑制CMS模型小鼠海马神经炎症Western b1ot实验结果显示,与正常对照组比较,CMS模型组小鼠海马炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白水平及IKKβ、P65的磷酸化水平显著升高。给予益母草碱(60mg/kg)治疗四周后,显著降低CMS模型小鼠海马炎性因子IL-1β、TNF-α、IL-6蛋白水平(P<0.01)及IKKβ、P65的磷酸化水平(P<0.05)。表明益母草碱可显著抑制CMS模型小鼠海马神经炎症。结论:1.益母草碱改善CMS模型小鼠的抑郁样症状。2.益母草碱的抗抑郁作用可能与抑制神经炎症、改善脑内神经递质水平异常有关。综上所述,本文创新之处:1.益母草碱具有抗抑郁作用,揭示了益母草碱的药理新作用,提示益母草碱可作为临床抗抑郁的潜在治疗药物。