论文部分内容阅读
目的:1.分析雌激素受体a(ERa)基因XbaⅠ和PvulⅠ酶切多态性和雌激素受体β(ERβ)基因Rsa Ⅰ和Alu Ⅰ多态性对女性Graves眼病患者的遗传影响。2.研究不同ER-a基因Xba Ⅰ位点基因型下女性Graves病患者(包括Graves眼病患者)外周血中CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞数量和雌二醇(E2)、白细胞介素-10(IL-10)、转化生长因子-β1(TGF-β1).肿瘤坏死因子-a(TNF-a)及甲状腺功能的异同。3.通过对女性GO患者治疗前后其外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中ERa和FoxP3基因的表达水平的检测,并与正常人群做比较分析,并以雌激素受体α基因Xba Ⅰ位点的3个基因型分为3组,进行组间的对比,观察ERa基因Xba Ⅰ多态性对ERa及FoxP3mRNA表达的影响,探讨ER-a基因Xba Ⅰ多态性在女性GO发病机制中的作用。方法:1.设立4组观察对象。分别为正常女性组,共126人;GD组,确诊为GD18个月以上,未出现眼征患者,共67人;GO-S组,诊断为GD后,18个月内出现眼征患者,共56人;GO-L组,诊断为GD后,18个月以上出现眼征患者,共40人;应用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)的方法,检测受试对象ERα基因PvuⅡ和XbaⅠ位点、ERβ基因Rsa Ⅰ和Alu Ⅰ位点多态性分布的情况;分析ERa基因与ERβ基因多态性与女性GO发病之间的相关关系。2.选取月经周期正常的初发女性GD患者72人,其中包括有眼征患者22人,同时选取月经正常的女性50人作为对照组,在月经期的卵泡期(月经后3-7天)采取空腹静脉血,采用电化学发光测试仪测定E2、TSH、FT3、FT4、TPOAb、 TGAb;化学发光法测定TRAb;流式细胞仪测定外周血单个核细胞(PBMCs)中CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞数量,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清中IL-10、TGF-β1、TNF-α的含量。以ER-a基因XbaⅠ位点基因型分为三组,比较三组上述指标的差异。3.选取女性活动性GO患者84名,泼尼松进行治疗,在治疗前后分别记录临床活动期评分(clinical activity score, CAS), E2浓度,并分离新鲜外周血单个核细胞,提取总RNA,利用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法逆转录并扩增ERα及FoxP3mRNA,通过凝胶图像系统对PCR产物的电泳条带进行扫描半定量分析。将84名患者以ER-a基因Xba Ⅰ多态位点的不同,分为三组,分别进行对比。结果:1.GO-S组AA基因型频率为80.4%,而正常对照组、GD组、GO-L组AA基因型频率分别为46.8%、59.1%和57.5%,差异有统计学意义(P=0.005)。并且,GO-S组与正常对照组、GD组、GO-L组差异具均有统计学意义(P值分别为0.000,0.04,0.042);将GD组、GO-S和GO-L合并与正常对照组相比较,AA基因型频率差异分为为66%和46.8%,差异具有统计学意义(P=0.004);GO-S组与GD组、GO-L组A等位基因频率分别为88.4%、75.4%和59.4%,计算暴露于A等位基因与GO-S的联系强度OR得出,GO-S组与GD组相比,暴露于A等位基因的OR(95%CI)为2.11(1.203-3.699),与GO-L相比,暴露于A等位基因的OR(95%CI)为2.45(1.312-4.575);正常对照组、GD组、GO-S组和GO-L组在Pvu Ⅱ多态性的分布差异不具有统计学意义(P=0.698):ERβ基因Alu Ⅰ位点多态性的分布中,正常组、GD、GO-S和GO-L4组AA基因型分布总体差异有统计学意义(P=0.032),其A等位基因频率分布总体差异也具有统计学意义(P=0.016)。GD、GO-S和GO-L3组间差异无统计学意义(P=0.910);GD、GO-S和GO-L3组数据合并,与正常对照组组进行统计学分析,其差异具有统计学意义(P=0.001)。计算暴露于A等位基因与GD的联系强度OR得出,与正常对照组相比,暴露于A等位基因的OR(95%CI)为1.71(1.272-2.299);正常对照组、GD组、GO-S组和GO-L组在AluⅠ多态性的分布差异不具有统计学意义(P=0.836)。2.对照组中,不同基因型人群其外周血的TSH、FT3、FT4、TPOAb、TGAb、 TRAb、E2、CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞及IL-10、TGF-β1、TNF-α的含量差异均无统计学意义;GD组中,不同基因型人群其外周血的TSH、FT3、FT4、TPOAb、 TGAb、TRAb、E2和TGF-β1的含量差异无统计学意义;GD组的E2、TNF-α的含量显著大于正常对照组(P=0.000),CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞数量显著少于正常对照组(P=0.000);GD组中,以GG基因型、GA基因型和AA基因型分为3组,GG组CD4+CD25+FoxP3+Treg细胞数量最多,AA组最少,差异具有统计学意义(P=0.015);GG组IL-10含量最多,AA组最少,差异具有统计学意义(P=0.004);GG组TNF-a含量最少,AA组最多,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.治疗前,CAS评分及E2浓度在GG、GA和AA基因型组间差异无统计学意义(P=0.684和P=0.714),治疗后,CAS评分及E2浓度均有下降,但GG组下降幅度最大,AA组较少,差异具有统计学意义(P=0.028);E2浓度差异无统计学意义(P=0.778);治疗前,GO组ERα mRNA表达明显高于对照组(P<0.05),GG组高于GA组和AA组,差异具有统计学意义(P=0.029和0.002),治疗后,GO组ERα mRNA表达明显下降(P<0.05),GG组高于GA组和AA组,差异具有统计学意义(P=0.039和0.014);治疗前,GO组FoxP3mRNA表达明显低于对照组(P<0.05),GG组高于GA组和AA组,差异具有统计学意义(P=0.039),治疗后,GO组FoxP3mRNA表达与治疗前相比明显上升(P<0.05),GG组高于AA组,差异具有统计学意义(P=0.002)。结论:1.在ERa基因Xba Ⅰ位点多态性方面,AA基因型与GD的发生有关,是GD的易感基因型,并且与GO的发生时间有着密切关系,是GO早发的危险因素;在ERβ基因AluⅠ位点多态性方面,等位基因A是GD的易感基因,AA基因型是GD的易感基因型,不是GO早发的危险因素:ERa基因PvuⅡ酶切位点多态性及ERβ基因Rsa Ⅰ位点多态性与GO的发生发展无关。2.ER-α基因Xba Ⅰ基因位点A等位基因的出现增多,抑制炎症因子IL-10减少,促炎因子TNF-α增多,最终导致AA基因型组CD4+CD25+Foxp3+Treg数量最少,而GG基因型组抑制炎症因子IL-10较多,促炎因子TNF-α较少,CD4+CD25+Foxp3+Treg数量最多,AA基因型组的免疫抑制力较差,可能导致了携带该基因型患者GO早发的几率增大。3.随着等位基因G的增多,ER-αmRNA和Foxp3mRNA也相应增多,治疗效果相对较好,G等位基因是保护性基因。可能由于ERa基因XbaI位点多态性导致的ER受体数量不同,影响E2促进Treg发挥免疫抑制功能,而使泼尼松治疗活动性GO患者的效果存在差异。