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研究目的:通过体外扩增健康志愿者外周血γδT细胞与结肠癌细胞共培养,研究γδT细胞体外杀伤结肠癌细胞株SW620和HCT116的细胞毒作用,并探讨γδT细胞联合重组人白介素-2(recombinant human interleukin-2,rh IL-2)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)诱导结肠癌细胞凋亡的作用。方法:(1)采集健康志愿者外周血,应用Ficoll密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMNC),置于含1umol唑来膦酸(zoledronate,Zol)及100 IU/ml rh IL-2的RPMI-1640培养基中培养扩增γδT细胞,第7-10天免疫磁珠法分选收集后应用流式细胞术检测γδTCR阳性细胞比率。(2)收获的γδT细胞与SW 620和HCT 116分别按不同的效靶比进行共培养,用乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放法测定对癌细胞的抑制率,流式细胞术检测其致凋亡率。(3)选择γδT细胞(效靶比10:1)联合不同浓度的rh IL-2与靶细胞共培养,用LDH释放法测定对癌细胞的抑制率。(4)预实验确定5-FU抑制结肠癌细胞株SW 620和HCT 116的半数致死量;LDH释放法检测γδT细胞联合IL-2和/或5-FU(半数致死量)对SW 620和HCT 116的抑制率,流式细胞术检测凋亡率。结果:(1)应用Zol及rh IL-2在体外培养扩增γδT细胞可获得较高并稳定的产率,培养10天的细胞经免疫磁珠分选收获的细胞中γδTCR阳性的细胞达98.45%。(2)γδT细胞对细胞株SW 620和HCT 116具有细胞毒性作用,其抑制增殖作用与致凋亡率均与γδT细胞和肿瘤细胞的效靶比相关。细胞作用6 h后,效靶比为40:1的γδT细胞对SW 620和HCT 116细胞增殖抑制率最高,分别达12.55±0.76%和9.36±0.61%;效靶比为40:1组的γδT细胞对SW 620和HCT 116诱导凋亡作用最强,凋亡率分别达18.26±0.63%和26.46±0.33%。(3)γδT细胞联合rh IL-2后对靶细胞的细胞毒作用增加且与IL-2浓度呈剂量-时间依赖相关。IL-2为400 IU/ml浓度时对SW 620和HCT 116作用24 h后抑制率分别为8.48±0.31%和18.53±0.75%,联合γδT细胞组抑制率为14.17±0.60%和20.82±0.90%。(4)5-FU作用于SW 620 48 h的半数致死量浓度约为400 ug/ml,5-FU作用于HCT 116 48 h半数致死量的浓度约为4 ug/ml,5-FU抑制HCT 116细胞增殖的效率优于SW 620。较低效靶比的γδT细胞和低浓度的IL-2均可增强5-FU杀伤癌细胞作用,提高抑制率和凋亡率。γδT细胞和IL-2联合5-FU对SW 620和HCT 116作用48小时的抑制率分别为60.62±1.14%和61.20±1.36%,诱导凋亡率分别为60.08±0.98%和67.31±0.11%。结论:健康志愿者来源的PBMNC在Zol及rh IL-2的作用下可稳定扩增γδT细胞,这些γδT细胞对SW 620和HCT 116有杀伤作用,能抑制上述细胞增殖并诱导凋亡。而低效靶比的γδT细胞和低浓度的IL-2均可增强5-FU杀伤癌细胞的作用,三者联合对癌细胞的细胞毒作用最强。