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海南捕鸟蛛是原产于中国海南、广西等地的一个捕鸟蛛种类。通过反相高效液相色谱技术偶联质谱技术,我们从海南捕鸟蛛中鉴定到了多种多肽成分。其中海南捕鸟蛛毒素-I(HNTX-I)就是从海南捕鸟蛛毒液中分离的一种神经毒素。首先通过电刺激蜘蛛螯肢富集的毒液经过冷冻干燥之后得到干粉,然后采用阳离子交换和反相高效液相色谱分离纯化得到单一组分HNTX-I。HNTX-I相对分子质量为3608.1Da,其氨基酸序列为 ECKGFGKSCVPGKNECCSGYACNSRDKWCKVLL,含有 6 个半胱氨酸(Cys)形成3对二硫键,一级序列包含两个相邻的半胱氨酸,二硫键配对方式为Ⅰ-Ⅳ、Ⅱ-Ⅴ、Ⅲ-Ⅵ。IK通道即中电导钙激活钾通道在平滑肌舒张过程中发挥着重要作用,该通道的激活能够产生降血压和缓解哮喘的效果。先前的膜片钳实验表明高浓度的HNTX-I对于河豚毒素敏感型钠通道和河豚毒素不敏感型钠通道没有什么明显的效果,100 μ M的HNTX-I对于表达在HEK293T细胞的hERG钾通道、表达在大鼠背根神经节(dorsal root ganglion)的L型Ca2+通道、T型Ca2+通道、hERG钾通道也没有什么作用。将100μM的HNTX-I施加到BK通道、IK通道和SK通道上,结果发现HNTX-I对于IK通道的作用最强,其对SK通道只有30%左右的激活作用,但是对BK通道并没有什么明显作用。这就证明了HNTX-I对IK通道的激活专一性很强,其对IK通道的EC50值大概是26μM左右,激活效果并不是特别好,所以如何使HNTX-I成为一个更强的IK通道的激活剂成为实验的重点。本课题构建了 HNTX-I的质粒表达载体,成功表达了 HNTX-I,质谱结果与野生的HNTX-I 一致,并利用膜片钳进行检测,发现它与野生的HNTX-I对IK通道的EC50差别不大。根据先前的实验可知防城港毒素-I(FCGTX-I)与HNTX-I有97%的序列同源性,仅第十五位的氨基酸残基不一样,而且高浓度的FCGTX-I对IK通道没有作用,可推测第十五位的氨基酸残基为IK通道有激活作用的关键残基。然后通过分子模拟与对接分别构建IK通道的6个通道突变体(W54、L56、F59、K62、R123、E149),经过膜片钳检测发现 L56、F59、R123、E149 这四个突变体与野生的IK通道的EC50值十分接近,都在25μM-29μM左右,但是HNTX-I对W54和K62这两个突变体无作用,由此确定W54和K62为IK通道上的关键残基,然后我们又根据分子模拟与对接构建了 E1F-HNTX-I、K13D-HNTX-I、N14F-HNTX-I 这 3 个 HNTX-I 的毒素突变体,通过膜片钳实验发现E1F-HNTX-I比野生的HNTX-I对IK通道的激活作用增强了 29倍左右。同时,在用表达成功的HNTX-I对IK通道突变体进行膜片钳检测时,用目前对IK通道激活作用很强的小分子激活剂NS309对这W54和K62这两个关键突变体进行检测,发现还是有很强的激活作用,表明HNTX-I与NS309对IK通道的激活位点是不一样的。