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细胞质膜(PM)是细胞与环境直接接触的界面。镶嵌或连接于其中的蛋白质作为细胞的“门铃”与“门户”,是现有的70%的药物的靶标,因此细胞质膜蛋白质组的研究具有重要的理论与实际应用意义。然而,由于质膜蛋白质具有难溶、低丰度以及组成复杂等特点,是一项具有极大挑战性的研究。 首先,本文以鼠肝为材料,对质膜蛋白质组的研究进行了一系列的方法摸索。肝脏在人体的生命活动中具有非常重要的功能,是一个复杂性仅次于大脑的器官。分析其质膜蛋白质组将有助于对肝脏的认识和肝病的治疗。我们用蔗糖密度梯度离心法纯化质膜,优化出适合2DE分离膜蛋白的裂解液(含4%w/v CHAPS和1%NP-40等)和初步摸索出整合膜蛋白质的富集方法(氯仿和甲醇抽提,Na2CO3处理)。对用2DE和SDS-PAGE分离的蛋白质进行质谱鉴定,一共鉴定了175个非冗余蛋白质。其中9%的蛋白质功能未知,生物学分析发现四个未知蛋白质可能与肌肉营养不良等疾病有关。其次,为了鉴定低丰度、强疏水性整合质膜蛋白质,我们用Na2CO3处理,氯仿与甲醇抽提,以及质膜微区分离策略来富集这些蛋白质。通过2DE/1DE-MS/MS的技术路线分析,一共鉴定了457个非冗余蛋白质,其中23%的带有一个或一个以上跨膜区(TM)。在这457个蛋白质中,有53个与细胞通信相关。对这些鉴定的蛋白质进行emPAI分析,发现有50%的蛋白质的浓度低于0.1M,其中12%的蛋白质浓度比arginase 1和actin的低100倍。对鉴定蛋白质的理化性质分析,发现Na2CO3处理有利于碱性蛋白质研究,氯仿与甲醇有利于多跨膜区蛋白质研究,微区策略有利于低丰度蛋白质研究。再有,为了提高质膜的纯度,采用抗体磁珠免疫亲和纯化方法来纯化质膜。通过对4种富集方法的比较,找到了最佳的纯化方法。与密度梯度离心的结果相比,这种方法能将质膜的纯度提高3倍,线粒体的污染减少了2倍,内质网的污染几乎被去除。随后,我们优化了初质膜、磁珠以及抗体的用量,得到了适合蛋白质组研究的较少用量。对纯化的质膜蛋白质进行SDS-PAGE分析,质谱鉴定。