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器官移植术已成为治疗终末器官衰竭患者的主要手段。为防治同种异体器官移植,临床常规应用免疫抑制药物,但由此导致感染和肿瘤发生率升高,且药物对慢性排斥反应无效。因此,探索防治移植反应的新策略具有重要临床意义。Medawar等于1953年在新生小鼠诱导出耐受,但人类诱导耐受的实验研究尚未取得突破性进展。数十年来,已报道大量与移植耐受相关的研究进展,尤其集中于以T细胞相关的实验方案。近年来,鉴于树突状细胞(DC)在激活T细胞中发挥重要作用,与DC相关的诱导移植耐受策略成为关注的热点。T细胞与DC间通过一系列表面分子而发生相互作用,包括TCR/pMHC、CD40/CD40L,CD28/CD80、CD86等,它们分别向T细胞提供第一信号和第二信号,直接参与T细胞激活。其中,若缺乏协同刺激信号(第二信号),可能导致T细胞无能或耐受。因此,封闭T细胞与DC表面某些协同刺激分子成为诱导免疫耐受的重要策略。已报道的其他实验方案包括:联合使用抗CD4和CD8抗体;输注供者骨髓而诱导嵌合体;输注供者骨髓来源的DC等。吲哚胺2,3-二氧化酶(IDO)是色氨酸代谢的限速酶,具有明显的免疫抑制效应。1991年Talor等人发现,IFN-γ可以诱导IDO产生,并证实IDO在诱导免疫耐受中发挥重要作用。近年来,IDO相关的移植免疫成为研究的热点。本课题将Ad-IDO转染供者骨髓来源的DC,将其过继输注受者,观察对移植物存活的影响,并初步探讨其机制,为干预移植排斥提供新策略。一、重组Ad-IDO的扩增,纯化和鉴定重组Ad-IDO(E1、E3区缺失;外源基因插入至E1区;以CMV为启动子,以SV40polyA为加尾信号)通过293细胞反复扩增至所需滴度,经超速离心而纯化。经PCR鉴定,在连续传代培养过程中,重组Ad-IDO均稳定整合有IDO基因。经Western blot和免疫组化鉴定,转染IDO的293细胞可表达IDO蛋白。二、重组Ad-IDO可延长异基因小鼠移植物存活时间以BALB/c小鼠为供者,C57BL/6小鼠为受者,进行腹部异位心脏移植。移植术前,在移植心脏四壁注射1010PFUAd-IDO或Ad-EGFP(对照组),同时设立未处理对照组。每组8只小鼠。结果为:1.移植物存活时间Ad-IDO组MST+SD=16.9+1.5天;AdGFP组MST+SD=8.1+1.0天;未处理对照组MST+SD=8.3+0.7天,p<0.01。2.受者淋巴细胞增殖功能经混合淋巴细胞培养实验发现,AdIDO组心脏移植物浸润的淋巴细胞对供者抗原反应性明显降低。3.移植心脏HE染色与AdGFP组和未处理对照组相比,Ad-IDO治疗组心肌组织中单个核细胞浸润明显减少,未出现毛细血管淤血、间质出血、动脉炎和静脉炎。4.移植心脏细胞因子mRNA表达移植术后采集各组移植心脏组织,提取总RNA,借助实时定量RT-PCR技术检测IL-2、IFN-γ、Foxp3和IL-17的mRNA表达水平,结果为:Ad-GFP组和未处理对照组IL-2、IFN-γ和Foxp3的mRNA表达水平相近,差异无显著性;与上述两组相比,术后5天,Ad-IDO处理组IL-2和IFN-γ的mRNA表达水平明显降低,差异有显著性(p﹤0.05), Foxp3的mRNA表达水平明显升高,该组IL-17 mRNA表达水平自术后3至7天逐渐降低。5.心脏移植物调节性T细胞比例移植术后5天进行流式细胞术分析,发现心脏移植物中浸润的CD4+CD25+调节性T细胞比例明显升高,Foxp3的mRNA表达水平明显升高。6.IDO与Treg相关性未处理的受者DC、Ad-IDO与未处理供者的CD4+CD25+调节性T细胞体外混合培养,可使后者扩增。三、转染Ad-IDO的BMDC过继输注可延长异基因小鼠移植物存活时间进行BALB/c小鼠→C57BL/6小鼠的皮肤移植。受者输注转染Ad-IDO的BMDC(供者来源),可使皮肤移植物存活时间明显延长(MST=36.5+3.4天)。1.BMDC表型转染Ad-IDO的BMDC其表型无明显变化,而LPS处理组CD80、CD86、MHCII分子表达明显升高。2.IDO蛋白表达和功能转染Ad-IDO后,BMDC和受者多器官可有效表达IDO;转染Ad-IDO后,BMDC表达的IDO可有效行使功能,表现为色氨酸代谢产物KYN升高。3.移植皮片HE染色移植术后不同时间点取移植皮片,制成石蜡切片,常规HE染色,观察移植物组织中炎性细胞浸润。术后5天的改变为:PBS处理移植组炎性细胞浸润明显,可见毛细血管淤血、间质出血;BMDC/Ad-IDO处理移植组未出现排斥反应,移植物组织仅见少量炎性细胞浸润;BMDC/Ad-GFP处理移植组未出现排斥反应,移植物组织可见部分炎性细胞浸润(较BMDC-Ad-IDO处理移植组多)。4.受者脾脏调节性T细胞变化皮肤移植5天后,流式细胞术检测,发现受者脾脏调节性T细胞比例明显升高,但IL-10水平未见变化,提示此群T细胞并非通过IL-10发挥调节作用。5.受者脾脏淋巴细胞对同种抗原反应性BMDC/Ad-IDO处理移植组,受者脾脏淋巴细胞针对供者组织抗原的反应性明显降低。6.二次移植物存活时间为检测BMDC/Ad-IDO诱导耐受的持续性,对第一次皮肤移植存活15天以上的受者,进行第二次心脏移植,心脏存活时间较C3H组明显延长。7.Ad-IDO转染BMDC对Treg分化的影响在体外,Ad-IDO转染的BMDC可诱导CD4+CD25-细胞转变为CD4+CD25+细胞8.IDO体外扩增CD4+CD25+细胞Ad-IDO转染的BMDC与未处理供者的CD4+CD25+调节性T细胞体外混合培养,可使后者扩增。9.CD4+CD25+细胞过继转移对移植物存活的影响取BMDC/Ad-IDO处理组小鼠脾脏,分离其CD4+CD25+细胞或CD4+CD25-细胞,过继输注未处理BALB/c小鼠,该小鼠24h后接受C57BL/6皮肤移植,输注CD4+CD25+细胞的小鼠皮肤移植物存活时间明显延长。结论1.成功扩增、纯化重组Ad-IDO,证明其携带小鼠IDO基因,可在体内、外表达,并有效行使功能。2.在成功构建重组Ad-IDO基础上,初步探讨其对移植排斥反应的影响及机制。结果发现:Ad-IDO可抑制同种反应性T细胞增殖和细胞因子分泌、促进CD4+CD25+Foxp3+细胞产生、抑制单个核细胞浸润并有效延长小鼠同种移植物(皮肤、心脏)存活时间。更为重要的是,发现Ad-IDO在体外可促进调节性T细胞扩增和转化。本课题初步成果提示:IDO相关的干预策略可抑制同种移植物排斥反应,并具有潜在的临床应用价值。