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目的:采用网络药理学及分子对接技术探寻木兰花碱和斯皮诺素发挥抗抑郁失眠协同作用的潜在作用靶点和机制;通过计算油水分配系数,探究联用前后不同p H对酸枣仁斯皮诺素和木兰花碱水溶性的影响;研究酸枣仁中斯皮诺素和木兰花碱联用对动物体内药动学参数的影响;考察木兰花碱-斯皮诺素联用的抗抑郁失眠疗效以及通过Akt-mTOR通路发挥抗抑郁失眠作用机制。方法:1.基于网络药理学方法对木兰花碱和斯皮诺素作用靶点及通路进行预测,应用Autoduck软件对木兰花碱斯皮诺素与抑郁靶点进行分子对接,通过计算受体与配体的结合自由能以及分析对接位点说明木兰花碱和斯皮诺素协同发挥抗抑郁失眠作用。2.采用摇瓶法模拟人体环境,以高效液相色谱法(HPLC)分别检测不同pH条件下单用及联用时木兰花碱和斯皮诺素的药物浓度,确定联用对木兰花碱和斯皮诺素油水分配系数的影响。3.以HPLC法分别测定静脉给药后木兰花碱组(17.0 mg·kg-1)、斯皮诺素组(23.7mg·kg-1)和木兰花碱-斯皮诺素组(17.0 mg·kg-1+23.7 mg·kg-1)不同时间点下各组小鼠的血药浓度,确定联用对木兰花碱和斯皮诺素体内药代动力学性质的影响。4.应用慢性温和不可预知应激(Chronic Unpredictable Mild Stress,CUMS)刺激结合水平台睡眠剥夺法构建小鼠抑郁失眠模型。通过检测小鼠体重增长率、悬尾不动时间、强迫游泳时间、戊巴比妥钠协同作用睡眠时间、自主活动次数等行为学指标,确定木兰花碱和斯皮诺素联用的抗抑郁失眠效果。5.采用qPCR法(Quantitative Real-time PCR,qPCR)检测木兰花碱高剂量组、斯皮诺素高剂量组、木兰花碱-斯皮诺素高剂量组、木兰花碱低剂量组、斯皮诺素低剂量组和木兰花碱-斯皮诺素低剂量组对CUMS抑郁失眠小鼠海马中IDO和白细胞介素1β(IL-1β)m RNA表达的影响,采用免疫印迹法(WesternBlot)检测各组小鼠海马中IDO、IL-1β、p-m TOR和p-Akt蛋白表达的差异,研究木兰花碱和斯皮诺素联用对Akt-mTOR通路的影响。结果:1.通过网络药理学预测出木兰花碱和斯皮诺素通过共同作用靶点蛋白单胺氧化酶B(MAO-B)和Metabolic pathways通路发挥协同抗抑郁失眠作用。分子对接结果显示,木兰花碱和斯皮诺素与抑郁相关靶点Akt-mTOR、IDO结合自由能较低,且既能与靶点上同一活性位点结合,又能作用于不同的活性位点,因此,木兰花碱和斯皮诺素联用可能是通过Akt-mTOR通路发挥协同抗抑郁失眠疗效。2.油水分配系数实验结果显示,在中性环境下,联用增加了斯皮诺素水溶性,同时增加了木兰花碱的脂溶性。3.药代动力学实验结果显示,联用可增加斯皮诺素和木兰花碱的最大血药浓度(Cmax),增大血药浓度曲线下面积(AUC),表现出较好的药物协同作用。4.CUMS抑郁失眠小鼠的行为学结果表明,高、低剂量木兰花碱-斯皮诺素联用可显著改善CUMS小鼠抑郁失眠症状:在悬尾实验(Tail Suspension Test,TST)和强迫游泳实验(Forced Swimming Test,FST)中,木兰花碱-斯皮诺素高剂量组与木兰花碱高剂量组和斯皮诺素高剂量组相比,TST、FST不动时间均降低;在阈下、阈上剂量戊巴比妥钠协同实验中,木兰花碱-斯皮诺素低剂量组与木兰花碱低剂量组和斯皮诺素低剂量组相比,睡眠百分比升高,睡眠时间无明显变化。5.根据q PCR结果显示,与木兰花碱低剂量组和斯皮诺素低剂量组相比,木兰花碱-斯皮诺素低剂量组小鼠海马中IDO、IL-1β的表达有所降低,呈现出一定的协同作用。与木兰花碱-斯皮诺素高剂量组相比,木兰花碱-斯皮诺素低剂量组小鼠海马内IDO、IL-1βm RNA表达均降低。根据Western Blot结果显示,与模型组相比,高剂量木兰花碱-斯皮诺素联用可显著增加小鼠海马中IDO、p-Akt、p-m TOR的蛋白表达。结论:木兰花碱和斯皮诺素通过共同靶点和通路发挥协同抗抑郁失眠作用,且两成分对于IDO、Akt和m TOR有相同的结合位点,也有不同的结合位点,因此表现出一定的协同性,同时发现两成分联用增加了近中性时木兰花碱的脂溶性和斯皮诺素的水溶性。小鼠静脉注射两成分后,增加了小鼠体内两成分的Cmax,增大了AUC。体内木兰花碱和斯皮诺素联用的药效学实验表明,联用可显著改善CUMS抑郁失眠小鼠的症状,抗抑郁失眠作用机制可能与降低IDO、IL-1β含量,增加Akt、m TOR的磷酸化水平有关。