研究背景由于关节软骨内无血管分布,且软骨细胞被周围基质成分所包围,因此软骨损伤后通常会发生不可逆的病理过程,引起关节功能改变。目前尚无结构、成分、力学性质与正常关节软骨类似的再生透明软骨,关节软骨损伤后修复仍是骨科学没有解决的难题。目前的多种治疗方法,如微骨折术、自体或异体组织(骨膜、软骨膜、骨软骨块)移植等,存在种种缺陷从而限制了其临床应用,并且不能获得满意的治疗效果。应用组织工程技术构建组织工程软骨或骨软骨复合体被认为是目前最有可能解决此难题的技术手段。组织工程包括三大因素：种子细胞、支架材料和信号因子。骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)具有多向分化潜能,已经被证实能够向骨、软骨等多种组织分化;由于体外培养细胞有失分化的风险,因此动员体内自体BMSCs修复软骨损伤是治疗软骨损伤的热点。SDF-1是骨髓基质细胞分泌的一种重要趋化因子,在神经、造血、血管形成、免疫与肿瘤发生及进展等方面发挥重要的作用。CXCR4为SDF-1的唯一受体,分布于多种细胞表面的唯一的特异性受体CXCR4结合。体内研究表明,造血干细胞的归巢能力与骨髓基质细胞和内皮细胞分泌的SDF-1有关,也与其本身表达CXCR4强弱有关。SDF-1能有效地维持细胞增殖周期,促使更多的细胞进入生长增殖状态；SDF-1在不同的细胞群体或在不同的环境中发挥不同的作用,目前机制还不清楚,尚需要更多研究去证实。所以本研究重点集中于SDF-1能否募集BMSCs并促进BMSCs向软骨细胞分化。组织工程修复软骨过程中,支架不仅起着固定和运载细胞的作用,其性质与孔径也会影响到细胞的性质和功能。目前已有多种支架用于软骨组织工程来修复软骨损伤,常用的有聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、聚乳酸—羟基乙酸(PLGA)、胶原、壳聚糖等。PLGA海绵支架是己被美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration FDA)批准可用于临床的医用材料。PLGA海绵支架有相互交通的三维空间,为细胞提供了广阔的生存环境,而且能够允许细胞在三维空间中运动和迁移,克服了体外单层培养时的细胞接触抑制现象；三维空间相互交通,可以允许细胞间进行信息传递、营养物质转运、代谢产物转运等；同时,细胞和细胞分泌的细胞外基质可以被限制在支架的三维结构中,有利于新生组织的结构改建和整合。综上,本实验欲利用PLGA海棉支架附载SDF-1,募集自体BMSCs,并利用软骨缺损部位微环境促进BMSCs向软骨细胞分化修复软骨缺损。因此本实验的研究内容有：第一,体内外验证SDF-1对BMSCs的趋化效应；第二,验证利用SDF-1促进BMSCs表达软骨特征蛋白,Ⅱ型胶原及糖胺多糖；第三,利用附载SDF-1的PLGA支架修复软骨缺损,以期为关节软骨损伤的治疗提供新思路,探索一条新途径。方法(1)分离、培养、并用流式细胞术鉴定BMSCs。(2)利用免疫组化方法验证SDF-1的特异抗体在BMSCs的分布。(3)体外利用Transwell板检测SDF-1对BMSCs的趋化效应。(4)体外BrdU标记BMSCs。(5)用附载SDF-1的PLGA支架植入软骨缺损动物模型中,验证SDF-1在体内对BMSCs的募集效应。(6)体外不同浓度SDF-1与BMSCs共培养,用实时荧光定量PCR(Real-time PCR),酶联免疫吸附试验(ELISA)、蛋白质印迹法(Western blotting)检测BMSCs表达Ⅱ型胶原及糖胺多糖的情况。(7)将成年雄性新西兰大白兔60只,随机分为4组：Group D(缺损对照组)、Group P (PLGA支架)、Group SP (SDF-1+PLGA支架)、Group AP(AMD+PLGA支架)；建立双膝关节股骨滑车软骨缺损模型(直径4 mm,深度3 mm),用附载SDF-1的PLGA支架植修复兔膝关节软骨缺损动物模型。术后4W,8W,12W利用国际软骨修复学会(ICRS)大体和组织学评分验证各组的修复效果。定量结果用均数土标准差表示,统计学分析使用SPSS软件采用Mann-Whitney检验,P<0.05为有统计学意义；组织学ICRS评分结果用中位数±四分位间距(medians±interquartile range M±QR)统计学分析使用秩和检验分析数据,P<0.008为有统计学意义。结果采用全骨髓贴壁培养BMSCs,分离培养后采用流式细胞术鉴定BMSC,CD90、CD44呈阳性,而血液来源分子表面标记CD14、CD45呈阴性。免疫组织化学证明,SDF-1的特异性抗体分布于BMSCs表面。体外Transwell趋化实验表明,随着SDF-1浓度增加,趋化的细胞数逐渐增多,当SDF-1浓度为50 ng/ml时,迁移细胞数达峰值。为验证SDF-1在体内可以募集BMSCs,将BMSCs体外BrdU标记,从静脉注入软骨缺损模型,结果发现,当SDF-1的附载浓为50 ng/ml时募集的BrdU标记的BMSCs最多。体外SDF-1与BMSCs共培养,RT-PCR，ELISA、WESTERN-bloting检测结果示,SDF-1刺激浓度为50 ng/ml时,BMSCs表达Ⅱ型胶原及糖胺多糖明显比对照组高。动物实验结果表明,术后12 W,附载SDF-1+PLGA支架组,软骨表面平整,缺损由透明组织修复,内有大量软骨细胞,表层细胞平行于表面,深层细胞成柱状排列,趋于正常,可见软骨下潮线；与周围正常软骨界线消失。甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原染色均为阳性。ICRS组织学评分结果示,术后4W、8W,SDF-1+PLGA支架组修复效果与裸支架组无明显统计学差异(P>0.008)；术后12W,附载SDF-1+PLGA支架组修复效果明显优于裸支架组(P=0.001)；在同一时间点,附载SDF-1+PLGA支架组修复效果优于对照组(软骨缺损组)(P<0.008)。结论(1)SDF-1体内外可募集BMSCso(2)SDF-1(50ng/ml)与BMSCs共培养后,可促进BMSCs分泌Ⅱ型胶原及糖胺多糖,有助于BMSCs向软骨细胞转化。(3)用附载SDF-1(50ng/ml)的PLGA支架复合体治疗软骨缺损,结果表明,附载SDF-1(50ng/ml)的PLGA支架复合体可以明显促进软骨缺损修复,生成类透明软骨组织,术后12 W,生成的修复组织与正常软骨组织结构相似。本实验为SDF-1募集自体BMSCs修复关节软骨损伤提供了实验与理论基础。