绝大多数文献报道细菌几丁质酶属诱导酶,需加几丁质的诱导才能合成,但也有个别组成型酶的报道。苏云金芽孢杆菌中几丁质酶是组成型表达还是诱导型表达?不同表达类型的菌株各占多大比例?到目前为止国内外未见报道。为了探索上述问题,本文进行了相关研究。通过改进的基础培养基和诱导培养基分别对77株产几丁质酶的Bt菌株进行培养,采用DNS法测定上清中几丁质酶活性,比较不同培养基中的酶活性差异,并用生物统计软件SPSS中的T-检测法分析实验数据,结果发现属于绝对诱导型的菌株极少,绝大多数属于组成型。此外,对不同表达类型的菌株,用葡萄糖培养基进行了验证。本文通过系统、严谨的实验,首次证明了绝大多数苏云金芽孢杆菌中几丁质酶的表达属于组成型。 在几丁质酶表达类型研究的基础上,挑选不同表达特点的Bt 14＃,Bt 75＃和Bt 21＃三株菌,利用PCR方法扩增包含调节区域在内的几丁质酶全长基因。经连接转化后,获得在Escherichia coli XL-Blue中正确表达的chiB全长基因,测序并将结构基因部分提交GenBank(登录号:EU373094,EU373095和EF197878)。利用生物信息学软件,与本实验室已克隆的组成型表达的Bt 15A3菌株的chiB全长基因序列比较,同源性分别为99％,96％,98％。此外,它们的上游调节区域序列的差异也很小,仅有六处碱基不同,分别位于-48bp, -67 bp, -100 bp, -184bp, -195 bp和-205 bp处。这为进一步深入研究几丁质酶基因表达调控机理提供了很好的研究基础。 cry1、cry3和cry4基因分别是对鳞翅目、鞘翅目和双翅目昆虫有毒杀作用的杀虫晶体蛋白编码基因。目前,Bt杀虫制剂主要针对的是危害作物的鳞翅目害虫。而在Bt菌株中,对鞘翅目和双翅目具活性的Cry3和Cry4晶体蛋白基因的检出率远远低于Cry1。那么,几丁质酶活性较高的Bt菌株中各类cry基因分布如何?为回答这一问题,本实验以49株产几丁质酶的Bt菌为实验材料,通过PCR的方法检测这些菌株中三类cry基因的分布情况。结果表明,cryl基因分布率最高,占57.1％,其次是cry4和cry3基因,分别占48.9％和32.6％。说明从产几丁质酶的Bt菌中,筛选出同时对鳞翅目、鞘翅目和双翅目有毒杀作用且能够抑制真菌的多功能菌株的可能性更高,这对Bt特异杀虫菌株的筛选工作具有重要意义。在目前的工业化发酵工艺过程中,在产生大量杀虫晶体蛋白的同时,几丁质酶是否也能大量的产生和积累?哪些因素利于几丁质酶的大量表达?本文用发酵培养基和NB培养基分别培养Bt菌株,DNS法检测发酵液上清的几丁质酶活性,发现发酵培养基的几丁质酶酶活力,比在NB培养基中的要高。通过对发酵培养基单因子组份的实验证明,大豆粉和酵母粉能够促进几丁质酶的表达,而无机盐会降低几丁质酶的表达量。在发酵条件方面,溶氧量的增多使表达的几丁质酶酶活力增加。该研究将为Bt的工业化发酵提供理论依据。