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肽聚糖(whole peptidoglycan, WPG)是乳杆菌细胞壁中的重要组分,新的研究指出乳酸菌的免疫赋活功能与WPG调节Toll样受体2/对核因子(TLR2/NF-κB)信号通路密切相关,但对乳杆菌是否通过该机制缓解牛乳过敏尚不清楚。故本实验提取可显著抑制p-乳球蛋白(β-Lg)过敏的嗜酸乳杆菌的WPG成分,首先通过细胞实验,分析嗜酸乳杆菌WPG对过敏小鼠脾淋巴细胞抗体分泌、淋巴细胞CD4+/CD8+比值、Th1/Th2、Treg/Th17型细胞因子生成及其mRNA表达的影响;进而构建β-Lg过敏动物模型,分析嗜酸乳杆菌WPG调节TLR2/NF-κB信号通路对β-Lg过敏发生发展的影响,并探讨嗜酸乳杆菌WPG调节TLR2/NF-κB信号通路与Treg/Th17平衡的相关性,研究将揭示乳酸菌抑制过敏的作用途径及其信号识别的分子机制,为益生菌及其制剂的开发利用提供依据。一、细胞培养实验1.分析不同浓度嗜酸乳杆菌WPG对小鼠原代脾淋巴细胞增殖及转化能力的影响。结果显示当WPG浓度在10-1000mg/L范围时能显著促进小鼠体外脾淋巴细胞增殖及转化(P<0.05),且表现出剂量依赖关系。2.分析不同剂量嗜酸乳杆菌WPG对致敏小鼠脾淋巴细胞亚型、Th1/Th和Treg/Th17型细胞因子及抗体分泌的影响。结果表明,WPG体外刺激致敏脾细胞后可显著抑制IgE和β-Lg-特异性IgE的产生,上调CD3+、CD4+细胞数及CD4+/CD8+比值,平衡T淋巴细胞亚群数量,并通过提高T-bet/GATA-3及Foxp3/RORyt比例来促进Th1/Th2及Treg/Th17细胞平衡,且与过敏组相比,中、高剂量WPG的作用效果显著(P<0.05)。二、动物实验分析不同剂量嗜酸乳杆菌WPG对致敏小鼠Treg/Th17细胞失衡及TLR2/NF-κB信号通路的影响。结果表明嗜酸乳杆菌WPG干预可有效缓解p-Lg过敏,与过敏组小鼠比较,中剂量(20mg/kg wt)及高剂量(20mg/kg wt)组小鼠血清总IgE和(β-Lg-sIgE水平明显降低(P<0.05)；同时不同剂量WPG均能够显著上调Treg型细胞因子及转录因子(TGF-β、Foxp3、CD25)的表达,而中高剂量WPG对Th17型因子(IL-17、RORyt)及炎性因子(IL-6、IL-23)的表达的下调作用较为明显,进而纠正Treg/Th17细胞失衡。此外,与过敏组相比,中及高剂量WPG组中小鼠脾脏TLR2/NF-κB信号被明显激活,且具有剂量依赖性。特别是在高剂量组中,Foxp3的基因表达与TLR2/NF-κB信号表达成正相关,而RORγt与其信号通路成负关性,且相关性显著(P<0.05)。本实验表明嗜酸乳杆菌WPG成分对β-Lg过敏症状具有一定抑制作用,其免疫机制可能与WPG激活TLR2/NF-κB信号转导通路,进而平衡T淋巴细胞亚群数量,调节Th1/Th2及Treg/Th17细胞失衡密切相关。